天然化合物G226抗肿瘤药效学评价及机制研究

【摘要】实验目的：Epipolythiodioxopiperazines(ETPs)类化合物是从真菌中提取出来的一种次生代谢产物,近年来发现这类化合物很多具有抗肿瘤作用。军事医学科学院车永胜课题组以Verticilin为母核,对其进行结构改造,合成得到新的具有抗肿瘤活性的衍生物G226。本课题对G226体内外抗肿瘤作用进行系统评价,并探索其抗肿瘤作用靶点和分子机制。方法与结果：第一部分G226体内外抗肿瘤作用评价采用磺酰罗丹明B蛋白染色法和CCK-8测定G226体外细胞毒实验,结果显示,(G226对包括白血病、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌和膀胱癌等在内的肿瘤细胞具有较强的增值抑制作用,没有明显的系统选择性,平均ICso为86.6nmol/L,抗肿瘤活性强于阿霉素(adriamycin,ADR,IC50=230.3nmol/L)。我们选用人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠皮下移植瘤模型评价该化合物体内抗肿瘤作用,结果显示0.5mg/kgG226,每三天给药1次,能显著抑制移植瘤的生长,第21天时抑瘤率达到60.82%。第二部分G226抗肿瘤作用机制研究第一节G226诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的发生及其相关机制根据第一部分结果,选用G226较敏感细胞株MDA-MB-231和MCF-7探究G226诱导自噬与凋亡的能力。流式细胞术结合WesternBlot发现G226能够剂量依赖和时间依赖地诱导肿瘤细胞发生凋亡,并且这种凋亡能够被Caspase抑制剂所逆转。G226诱导的细胞凋亡主要通过死亡受体通路,G226能够激活Caspase-8,以及下游Caspase-3/7和Caspase-9,引起Bid切割,导致线粒体膜电位改变,诱导肿瘤细胞发生凋亡。但该化合物对线粒体通路重要调节蛋白Bax,Bcl-2和Bcl-xl的表达则无影响。免疫荧光结合WesternBlot技术进一步发现G226同样也能诱导肿瘤细胞发生自噬,并且自噬抑制剂3-MA和溶酶体抑制剂CQ在阻断自噬发生的同时,能够逆转G226诱导的凋亡。为了探究自噬与凋亡的关系,我们采用免疫荧光技术荧光共定位发现G226能够诱导Caspase-8与p62和LC3相互作用形成复合体。利用siRNA技术分别沉默LC3和p62,发现均能一定程度逆转G226诱导的Caspase-8和Caspase-3/7的切割与激活,同时沉默LC3也能部分逆转细胞凋亡的发生,表明LC3和p62是G226诱导Caspase的激活和细胞凋亡所必需的。但是沉默p62并不能阻滞G226诱导肿瘤细胞凋亡的发生。第二节G226抗肿瘤作用不完全依赖于其对TopoⅡ的抑制。采用DNA拓扑异构酶介导的supercoiledpBR322DNA解旋反应和kDNA去连环反应证实G226能够特异性抑制TopoⅡ的活性,且分子水平上G226靶向抑制TopoⅡ的作用强于阳性药依托泊甙(etoposide,VP16)。同时,中性单细胞凝胶电泳实验、WesternBlot技术和流式细胞术发现G22还能够诱导DNA损伤、细胞凋亡和细胞G1期阻滞。随后我们采用TopoⅡα亚基低表达、TopoⅡβ亚基缺失的HL-60/MX2和HL-60细胞模型,比较分析G226对两株细胞的作用差异。在相同条件下,G226在两株细胞株中均能诱导DNA双链断裂、诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖,且作用强度类似。在增殖抑制试验中,G226对HL-60/MX2的耐药因子(RF)仅为3.5,同样条件下TopoⅡ毒剂VP16和ADR则发生明显耐药,耐药因子分别为86.9和26.4,而TopoⅠ抑制剂CPT和SN38耐药因子分别为1.6和1。以上结果表明G226诱导的DNA损伤、细胞凋亡及死亡并不完全依赖于其对TopoⅡ的抑制。第三节G226影响多个Hsp90客户蛋白表达WesternBlot检测细胞周期调控相关蛋白变化,结果显示,G226引起细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4和CDK6以及DNA损伤修复通路Chkl蛋白的表达显著下调,使细胞不同通过G1期检测点和损伤修复,这可能是G226引起细胞G1期阻滞的原因。CDK4、CDK6和Chkl均为Hsp90的客户蛋白,此外G226作用后还可下调Akt,Raf、Her2、Met以及EGFR等多个Hsp90的客户蛋白,与Hsp90抑制剂AUY922作用相应细胞的结果相一致。此外,G226还能和大多数Hsp90抑制剂一样,在导致其客户蛋白减少的同时,也会导致热休克蛋白Hsp70反馈性上升。这些结果强烈提示G226可能靶向抑制Hsp90。但在用荧光偏振试验探究G226是否能在分子水平与Hsp90结合抑制其活性时,发现10μmol/LG226作用后抑制率仅为23.37%,与我们预期结果不一致。因此G226对Hsp90的相互作用有待进一步研究。第四节G226升高肿瘤细胞内活性氧水平发挥其抗肿瘤活性采用DCFH2-DA和HE荧光探针结合流式细胞术测定HL60和HL60/MX2细胞内的H202和02·-水平,结果显示G226浓度依赖地刺激细胞内H202和02·-水平升高。相同实验条件下,抗氧化剂glutathione(GSH)、N-acetylcysteine(NAC)和蛋白巯基保护剂二硫苏糖醇(dithiotheitol,DTT)消除G226介导的细胞内H202和02·-水平的升高同时,也逆转了G226引起的γ-H2AX表达水平的上升；此外运用流式细胞术和WesternBlot方法也证实抗氧化剂GSH和NAC均能够逆转G226诱导细胞凋亡,以上结果表明G226引起的细胞内ROS的上升是G226诱导DNA损伤和细胞凋亡的主要因素。WesternBlot显示抗氧化剂GSH和NAC同样也能逆转G226引起的多个Hsp90客户蛋白的下调以及Hsp70的上升。此外,在TopoⅡ介导的supercoiledpBR322DNA解螺旋反应中,GSH可以浓度依赖性地逆转G226介导的TopoⅡ抑制作用,提示G226可能通过修饰TopoⅡ上的巯基而抑制其活性。结论：天然化合物G226是由军事医学院毒物药物研究所在Verticilin结构上进行优化而得到的一个全新化合物。本研究证实G226具有显著的体内外抗肿瘤作用。该化合物有强烈地诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的能力。其通过诱导自噬发生,促进细胞内LC3与Caspase-8复合体的形成,激活Caspase8,促进肿瘤细胞发生凋亡。此外,(G226通过刺激肿瘤细胞内活性氧的生成及／或修饰TopoⅡ上的巯基,从而导致TopoⅡ的活性被抑制诱导DNA双链断裂的发生,也可下调Hsp90相关客户蛋白的表达,最终导致肿瘤细胞凋亡。(G226的抗肿瘤作用机制较复杂,我们的研究为G226及其衍生物的继续开发及全面认识该化合物的抗肿瘤作用奠定了基础。
【作者】何鹏兴；
【导师】丁健；何俏军；
【作者基本信息】浙江大学，药理学，2014，博士
【关键词】ETP；G226；apoptosis；autophagy；ROS；TopoⅡ；Hsp90；

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