基于代谢组学的琼玉膏延缓衰老作用评价及机制研究

【摘要】中医药在干预衰老方面具有独特的优势,古籍中流传下很多抗衰名方,琼玉膏就是其中之一,被历代养生家所推崇。然而关于琼玉膏延缓衰老作用机制的现代研究还停留在初级阶段,限制了它的应用与推广。因此,应当建立一套能够体现中医药特点,将系统论与还原论相结合的研究方法。目的：本课题拟通过对琼玉膏干预后的衰老模型大鼠血清、尿液进行代谢组学检测,并与正常组、模型组、对照组相比较,观察代谢产物的变化,寻找代谢路径,分析琼玉膏延缓衰老的作用机制；并与公认的抗衰剂维生素E和经典中成药六味地黄丸进行对比,评价其抗衰老效果。为深入评价琼玉膏延缓衰老的功效,探讨琼玉膏延缓衰老可能的代谢组学机制提供依据；为琼玉膏的进一步开发应用奠定基础。方法：将60只SD大鼠,雌雄各半,随机分为5组：空白对照组、模型组、琼玉膏组、西药对照组(维生素E)、中药对照组(六味地黄丸),每组12只。空白对照组每天给予蒸馏水灌胃10ml·kg-1,皮下注射生理盐水2.5ml·kg-1；模型组每天给予蒸馏水灌胃10m1·kg-1,皮下注射D-半乳糖2.5m1·kg-1；琼玉膏组每天给予琼玉膏灌胃10ml·kg-1,皮下注射D-半乳糖2.5ml·kg-1；中药对照组每天给予六味地黄丸灌胃10ml·kg-1,皮下注射D-半乳糖2.5m1·kg-1；西药对照组每天给予VitE灌胃2ml·kg-1,皮下注射D-半乳糖2.5ml·kg-1.连续用药60d,通过形态观察和行为学测试(Morris水迷宫)检测造模是否成功。末次给药后用代谢笼收集24h尿液,加1滴质量体积比为1/100(w/v)的叠氮化钠,备用；将大鼠用10%的水合氯醛按照3ml·kg-1的剂量腹腔注射麻醉,行腹主动脉采血至10ml采血管,血浆静置后,使用低速离心机取血清,备用。将血清、尿液分别加血清缓冲液、尿液缓冲液,低温高速离心取上清液置于核磁管,利用NMR技术进行代谢组学检测。使用TopSpin软件(V3.0)对谱图进行预处理；使用SIMCA-P+软件(V11.0)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析,如主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、正交偏最小乘-判别分析等；使用matlab7.0软件对个别组内代谢物的相关性进行分析,最后将获得的差异代谢物输入KEGG数据库查找相关代谢通路。结果：1.一般情况及模型验证：造模前后各组大鼠间的体重比较,P>0.05无统计学意义,分组体重无差异。Morris水迷宫结果为,与空白对照组相比,模型组、琼玉膏组、中药对照组、西药对照组在前5天均有明显差异(P<0.05),第6天仅模型组有差异(P<0.05),其他组间差异不明显(P>0.05)。与模型组相比,从第4天开始,各组均有明显差异(P<0.05)。2.NMR谱图主成分分析：PCA分析图显示,血清各组样本分布总体较为清晰,R2X=80.6%,Q2=0.718,有显著差异；而尿液各组样本分布较为分散,R2X=59.8%,Q2=0.475,差异不大。3.琼玉膏抗衰老作用评价：经PLS-DA分析,三个用药组,即琼玉膏组、西药对照组、中药对照组,均与模型组有明显差别。尤其西药对照组和模型组区别最明显(R2Y=0.935,Q2=0.799)；琼玉膏组和模型组的区别也很明显(R2Y=0.931,Q2=0.826),且西药对照组和琼玉膏组没有显著差别(R2Y=0.755,Q2=0.002)。4.差异代谢物筛选：本次研究共筛选、鉴定出血清46种、尿液18种差异代谢物,相关系数|r|>0.576有统计学意义。其中在衰老动物模型血清样本中变化显著的有1-甲基组氨酸、醋酸盐、丙酮、乳酸盐、柠檬酸、谷氨酸、丙酮酸、琥珀酸盐、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸等33种差异代谢物,而琼玉膏可以调节其中27种代谢物的变化。尿液样本中变化显著的有乙酰乙酸、马尿酸盐、二甲基甘氨酸、琥珀酸盐等9种差异代谢物,琼玉膏可以调节其中3种差异代谢物的变化。其中醋酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸等代谢物与衰老变化联系较为紧密。5.代谢通路分析：差异代谢物主要涉及糖代谢、氨基酸代谢、能量代谢、核苷酸代谢、辅酶因子与维生素代谢、脂代谢等多条代谢通路。结论：1.模型组找到平台的时间明显长于其他组,造模成功；琼玉膏等用药组对D-半乳糖引起的学习记忆能力下降有改善作用。2.在本次研究中,琼玉膏抗衰老作用主要表现于血清,而对尿液的影响较小。3.琼玉膏抗衰老作用评价：琼玉膏能够调节衰老大鼠体内代谢物的变化,其有效性与公认抗衰剂维生素E相似,优于六味地黄丸的抗衰功效。4.明确琼玉膏延缓衰老作用机制相关的主要差异代谢物有醋酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸等。5.琼玉膏延缓衰老的作用机制与多个代谢通路有关,尤其是糖代谢中的丙酮酸代谢、能量代谢中的氧化磷酸化以及涉及谷氨酸的氨基酸代谢。提示琼玉膏延缓衰老的作用机制可能与线粒体损伤与脑退化有关。
【作者】曲卫玲；
【导师】刘焕兰；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医养生学，2014，博士
【关键词】琼玉膏；延缓衰老；代谢组学；作用机制；核磁共振；

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