基于水蛭传统给药的抗凝活性组份的相关研究

【摘要】目的：水蛭(HirudenipponicaWhitman,HIRUDO)最早记载于《神农本草经》,是我国传统中药材,有逐血祛瘀之效,现已广泛用于多种心脑血管疾病,疗效较好。水蛭素(Hirudin)被认为是水蛭中抗凝活性组份,研究报导较多。水蛭经高温处理后其水蛭素抗凝活性失活但其提取所得组份依然具有抗凝活性。2010版《中国药典》记载水蛭为水蛭科动物蚂蟥(WhitmaniapigraWhitman)、水蛭(HirudenipponicaWhitman)或柳叶蚂蟥(WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥全体。单方使用水蛭符合中医药理论的理、法、方、药,即水蛭提取的总有效部位的总体疗效比单一成分疗效更强,因此水蛭有效部位(组份)的使用更符合中医药理论。水蛭传统的给药方式均经口服,但其气味腥臭,难以吞咽,且容易变质,稳定性差。本研究基于传统的口服给药方式,以宽体金线蛭(WhitmaniapigraWhitman)为研究对象,对宽体金线蛭的抗凝血活性组份的提取工艺进行研究,并对其提取组份进行了药效学、毒理学研究,为水蛭口服给药存在的气味腥臭、难以吞咽等问题予以改进。本研究结果提示,所得提取组份可代替水蛭干燥全体入药,可以克服水蛭传统给药存在的部分问题,为水蛭的剂型研究提供新的思路。方法：1水蛭抗凝活性粗提取组份提取工艺研究比较了三种不同提取方法(即水提醇沉法、醇提水沉法、丙酮提取法)所得提取组份对抗凝活性和血浆复钙时间的影响,确定水提醇沉为较优的提取方法,并进一步通过星点设计-效应面优化法优选最佳提取工艺。2水蛭抗凝粗提取组份凝胶柱层析分离纯化按最佳工艺提取所得水蛭粗提取组份用DEAESephadexA-50、SephadexG-50凝胶柱进行分离纯化得抗凝活性组份A1、G1,并比较了水蛭粗提取组份、A1、G1三者的抗凝活性。3凯氏定氮法测定实验所得产品的蛋白质含量用凯氏定氮法测定实验所得样品蛋白质含量。4活性组份抗血栓药效学实验研究将抗凝活性组份G1用于体内外抗血栓实验,包括G1对大鼠动静脉旁路循环实验性血栓形成的影响、对体外血栓形成的影响、对大鼠血小板、胆固醇及血浆比粘度的影响、对全血浆凝块及优球蛋白溶解的影响、对大鼠脑毛细血管通透性的影响、对血小板聚集性的影响等,探讨其抗血栓作用机制。5活性组份慢性毒性实验研究本研究对抗凝活性组份G1的慢性毒性做了详细研究,具体方法为：SD大鼠连续灌胃给药60天,观察各实验动物一般健康指标、体重变化、血常规指标检查(WBC、NEU、LYM、NEU%、LYM%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC和PLT)、肝肾功能指标检查(SGPT、SGO、BUN、Cr)、其他血清生化指标(血糖、胆固醇、总蛋白、白蛋白,碱性磷酸酶)以及对重要器官心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、胰腺、脑、睾丸、子宫和胸腺组织的脏器系数及组织形态结构的影响等,来评价抗凝活性组份G1的长期毒性。6活性组份急性毒性实验研究选择NIH小鼠给予临床用量的70倍,给药后观察小鼠7天内饮食、活动、大小便及死亡情况。结果：1水蛭抗凝活性粗提取组份提取工艺研究水提醇沉组和醇提水沉组所得的水蛭粗提组份抗凝血活性效价高,丙酮组较低。为此,本实验选择蒸馏水作为提取溶剂。并经实验优化得最佳提取工艺：水蛭药材浸泡4h后提取三次,每次提取时间1.5h,溶剂水用量为药材的10倍,醇沉浓度为50%,醇沉静置时间20h。经验证试验证实,所建立的数学模型预测性较好,工艺条件重现性好,偏差率低。2水蛭抗凝粗提取组份凝胶柱层析分离纯化水蛭粗提取组份经过阴离子交换剂DEAESephadexA-50层析分离,得到三组活性组份,分别标记为A1、A2、A3,测定它们的抗凝血活性后,选择抗凝血活性最强的活性组份A1(166.52±0.21U/g)进行下一步SephadexG-50凝胶柱层析纯化,得到抗凝血活性更强的组份G1(225.28±1.03U/g),远高于中国药典所规定的要求。研究表明,经水煎煮提取、浓缩、干燥等高温处理后的水蛭提取组份尚有明显的抗凝血活性,说明除水蛭素外,水蛭中还有其它的抗凝血活性成分的存在。2凯氏定氮法测定实验所得产品的蛋白质含量凯氏定氮法测定A1、G1蛋白质含量,其蛋白质含量明显低于水蛭粉、水蛭粗提取组份的总氮含量。但它们的抗凝血活性明显高于水蛭粉及水蛭粗提取组份的抗凝血活性,研究表明水蛭抗凝血活性与总氮含量之间的关系尚需进一步深入研究。3活性组份抗血栓药效学实验研究药效学研究表明抗凝活性组份G1能抑制大鼠动静脉旁路循环实验性血栓的形成,显著降低大鼠血小板数量及抑制血小板聚集,降低血浆粘度以及缩短小鼠全血浆凝块溶解时间和优球蛋白溶解时间,减轻大鼠不完全性脑缺血的脑血管通透性。4活性组份慢性毒性实验研究抗凝活性组份G1长期毒性实验结果表明：在20、10、5mg/kg剂量范围内,SD大鼠给药及停药期间一般状况良好,粪便成形、行为活动、进食、体重增长情况均无异；给药组大鼠60天及停药15天的血常规、肝肾功能、血液生化指标及重要器官的脏器系数等实验指标与对照组基本相同,无显著性差异(P>0.05)。给药60天及停药15天各组大鼠器官的组织病理学检查结果显示：各器官组织形态结构与正常对照组基本相同,未见明显病理改变,脏器未见明显毒性损伤。5活性组份急性毒性实验研究急性毒性实验表明,小鼠一次灌服5Omg/kg抗凝活性组份G1溶液的最大给药量30g生药/kg,无小鼠死亡现象发生,组织器官切片均无异常。结论：1.水蛭粗提组份经过DEAESephadexA-50、SephadexG-50凝胶柱分离纯化,获得抗凝活性显著增高活性组份A1,G1,本研究所采用的分离纯化方法简单,环保。其中抗凝活性组份G1的抗凝血作用强,可望在临床上用于血栓性疾病的治疗。2.水蛭粗提取组份的蛋白质含量最高,但其抗凝活性明显低于纯化后的活性组份A1,G1,说明提取所得各组份的抗凝活性和其中含氮量无线性关系。此外,此结果提示提取组份中的某些不含氮的化合物也可能通过其他凝血机制发挥抗凝活性作用,尚需进一步深入研究。3.通过一系列的药效学实验和毒理学实验,说明本研究所得抗凝活性组份基本无药理毒性,使用安全、抗凝活性高,可以代替水蛭入药以克服水蛭传统口服存在的问题并为水蛭的剂型研究提供参考。
【作者】李宝红；
【导师】程怡；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】宽体金线蛭；提取；抗凝活性；药效学；毒理学；

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