香莲方对白念珠菌生物膜体外模型影响的代谢组学研究

【摘要】目的：1.观察香莲外洗液对白念珠菌生物膜的抗真菌效力。2.从代谢组学角度探讨香莲外洗液对白念珠菌生物膜的抗真菌作用机制。方法：1.将香莲外洗液作用于白念珠菌标准株SC5314,按照CLSI提出的标准(M27-A方案),采用肉汤微量稀释法测定香莲外洗液和氟康唑对标准菌株的MIC值。2.参照RamageGW等”StandardizedmethodforinvitroantifungalsusceptibilitytestingofCandidaalbicansbiofilms”一文,建立白念珠菌生物膜体外模型。3.采用XTT减低法测定香莲外洗液、氟康唑对不同成熟程度(4h、24h、48h)白念珠菌生物膜的最低粘附抑菌浓度(SMIC50、SMIC80)。4.用香莲外洗液、氟康唑预先包被96孔培养板,采用XTT减低法测定香莲外洗液、氟康唑预先包被96孔培养板后对白念珠菌生物膜形成的影响。5.采用UPLC-Q-TOF-MS分别对以下样品进行代谢组学检测：香莲外洗液和氟康唑作用后的悬浮菌；香莲外洗液和氟康唑作用后的早期(4h)、中期(24h)、成熟期(48h)生物膜；香莲外洗液和氟康唑预先包被96孔板,生长受抑制的生物膜。结果：1.香莲外洗液对白念珠菌悬浮菌的MIC为1.95mg/ml；氟康唑对该菌株悬浮菌的MIC为4μg/mL。2.香莲外洗液对4h、24h、48h的白念珠菌生物膜的SMIC5o分别为7.81、125和500mg/ml,SMIC80分别为31.25、250和>1000mg/ml;氟康唑对4h、24h、48h的白念珠菌生物膜的SMIC5o分别为32、64和>1024μg/mL,SMIC80分别为64、128和>1024μg/mL。3.用香莲外洗液预先包被96孔培养板,当药物浓度达到62.5mg/ml,对白念珠菌生物膜的形成具有抑制作用；用氟康唑预先包被96孔培养板,当药物浓度达到64μg/mL时,对白念珠菌生物膜的形成具有一定抑制作用。4.对白念珠菌悬浮菌和生物膜的代谢轮廓分析表明,两者各自代谢轮廓分离明显,但24h与48h生物膜的代谢模式较相似,存在较大重叠部分。通过对差异代谢物的分析鉴定表明：m/z为486.1647、377.1950的代谢物可能是悬浮菌与早、中、成熟期生物膜代谢比较后潜在的差异代谢物,m/z为486.1647的代谢物,它被初步鉴定为Cysteinyl-Threonine,是半胱氨酸和苏氨酸组成的二肽,是一个分解蛋白质消化分解代谢不完整的产物；m/z为377.1950的代谢物被初步鉴定为Pentosidine(戊糖),可能与磷酸戊糖通路有关。5.对药物干预后的白念珠菌悬浮菌的代谢分析表明,香莲外洗液组、氟康唑组和未加药物的阳性对照组3者的代谢模式可以较好分离。经鉴定,m/z为247.0964为可能的差异代谢物,它被初步鉴定为Lipoamide,它是谷胱甘肽的氧化形式,谷胱甘肽是一种含Y-酰胺键和巯基的三肽,由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。6.香莲外洗液、氟康唑干预后的早期(4h)、中期(24h)、成熟期(48h)的白念珠菌生物膜,其代谢模式均发生改变,均能较好地与未加药物阳性对照的早期(4h)、中期(24h)、成熟期(48h)生物膜分离。结果表明,m/z为206.0810的代谢物可能是不同药物作用后4h生物膜的潜在差异代谢物,被初步鉴定为Quinaldicacid(喹哪啶酸),是L-色氨酸分解代谢的产物；m/z为379.2098的代谢物可能是不同药物作用后24h生物膜的潜在的差异代谢物,被初步鉴定为Tyrosyl-Arginine(酪氨酰-精氨酸),是一种酪氨酸和精氨酸组成的二肽,是蛋白质消化或蛋白质分解的不完全分解产物,大多数只是作为进一步水解的途径上特定的氨基酸降解途径短暂的中间体,些具有生理或细胞信号的影响；m/z为387.1754的代谢物为可能是不同药物作用后48h生物膜的差异代谢物,被初步鉴定为Indoleacetylglutamine(吲哚乙酰谷氨酰胺),是色氨酸的吲哚衍生物,是色氨酸代谢的分解产物。7.不同浓度的香莲外洗液干预早、中、成熟期的白念珠菌生物膜后的代谢比较,结合载荷图及VIP值,发现m/z为201.1121的代谢物为可能的差异代谢物,它被初步鉴定为4-Hydroxynonenal,是脂质过氧化的主要终产物之一,已被证明它参与信号转导,可以影响细胞周期；不同浓度的氟康唑干预早、中、成熟期的白念珠菌生物膜后的代谢比较,结合载荷图及VIP值,发现m/z为175.0218的代谢物为可能的差异代谢物,被初步鉴定为3Dehydro-L-gulonate(3-脱氢-L-古洛糖酸),是D-Xylulose5-phosphate(D木酮糖-5-磷酸)合成的第四至最后一步,与酪氨酸和色氨酸的代谢、脂肪和类脂的代谢等多方面具有重要意义。8.香莲外洗液、氟康唑预先包被96孔培养板对形成的白念珠菌生物膜代谢模式产生影响,可以较好分离。其中,m/z为144.9225的代谢物被初步鉴定为Superoxide(超氧化物),是O2的阴离子形式,它的生物毒性可以灭活多种代谢途径的酶,从而导致细胞损伤,是氧化应激的一个主要因素。结论：1.香莲外洗液的MIC为1.95mg/ml时与氟康唑的4μg/mL对该菌的效力相当,为香莲外洗液、氟康唑对该菌株的MIC提供了参考依据。2.香莲外洗液、氟康唑对不同成熟程度的白念珠菌生物膜具有不同的抑制作用。但两种药物对生物膜的SMIC均是悬浮菌MIC的10倍左右,说明白念珠菌形成生物膜后,对药物的敏感性大大降低,但香莲外洗液对白念珠菌生物膜依然具有抑制作用。3.香莲外洗液和氟康唑预先包埋96孔培养板对白念珠菌生物膜的形成均具有抑制作用。4.白念珠菌浮游菌与生物膜在代谢过程中,主要涉及了糖代谢、氨基酸代谢途径的改变。在不同药物干预、不同形态下的白念珠菌出现磷酸戊糖通路、D-蛋氨酸、苯丙氨酸、L-色氨酸、酪氨酰-精氨酸、色氨酸等多种代谢途径代谢产物的显著差异。推测糖代谢、氨基酸代谢可能在悬浮菌转变成生物膜形态中扮演重要角色,可能与酵母—菌丝形态调控作用相关,也可能与生物膜形成后膜内微环境改变等相关,有待进一步深入研究。5.超氧化物对不同药物预先包被的96孔培养板形成生物膜的能力有较大影响。提示氧化应激在不同药物干预生物膜的形成中起重要作用,推测药物的作用下,可能诱导细胞产生氧化应激反应,从而抑制细胞的生长繁殖,值得进一步深入探讨。
【作者】袁娟娜；
【导师】范瑞强；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】白念珠菌生物膜；代谢组；香莲外洗液；

【参考文献】
[1]张超.SiC高功率MOSFET实验研究[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[2]王立国.二维地震资料在巴彦浩特地区地热资源勘查中的应用[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2013,硕士.
[3]李芝乐.PMLSM伺服系统的特征模型及其迭代学习控制方法[D].浙江工业大学,2012.
[4]刘艳莉.新世纪企业文化创新研究[D].哈尔滨工程大学,2004.
[5]邓艳钦.延安时期党对青年知识分子的思想政治教育及当代启示[D].中南民族大学,思想政治教育,2013,硕士.
[6]李朋朋.西安市高职院校体育教学现状及对策研究[D].西安体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[7]于文雯.镍钛—不锈钢激光焊复合弓丝细胞毒性的检测[D].吉林大学,口腔医学（专业学位）,2014,硕士.
[8]翁颖钧,朱仲英.ERP若干前沿研究的探讨[J].微型电脑应用,2002,04:12-15.
[9]公倩.人源Fab噬菌体抗体库的构建及Amylin抗体的筛选与鉴定[D].天津医科大学,内科学,2010,硕士.
[10]席会.初中生数学解题思维障碍研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[11]于春华.基于数据挖掘技术的医院器材管理决策支持系统[J].医疗卫生装备,2005,10:37-38.
[12]朱东方.傅路德：美国汉学的实践者与引导者[D].华东师范大学,史学理论及史学史,2013,硕士.
[13]滕超.俄语语言世界图景中的“心灵”观念[D].浙江大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[14]朱永刚.我国上市商业银行股权结构与经营绩效关系的研究[D].云南财经大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[15]梁曦.我国商业银行投资价值分析[D].首都经济贸易大学,金融学,2013,硕士.
[16]李倩.磁性纳米粒子的多巴胺仿生修饰及金属化的研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[17]王洪超.α-硫辛酸对杏仁核电点燃慢性癫痫大鼠海马CaMKⅡa表达的影响[D].河北医科大学,神经病学,2014,硕士.
[18]郑阿竹.企业环境对女性创业动机的影响研究[D].合肥工业大学,企业管理,2013,硕士.
[19]许怀智,张岳桥,王贵重,刘兴晓,周成刚,路鹏程.塔里木盆地瓦石峡凹陷侏罗纪构造演化与油气地质条件[J].石油地球物理勘探,2010,01:129-135+164+174-175.
[20]孟江.紫外光诱导产生乙烯酮双烯中间体的分子内[4+2]反应研究[D].哈尔滨工业大学,生物医学工程,2013,硕士.
[21]胡磊.三氧化二砷对三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的化疗增敏作用[D].复旦大学,外科学,2012,硕士.
[22]索鑫.基于低端存储器测试平台的A/D转换器测试方案开发与实现[D].复旦大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[23]罗刘敏.自动组卷系统的设计与实现[D].南京理工大学,计算机技术,2011,硕士.
[24]孟弘.我国石墨产业转型升级的科技对策[J].高科技与产业化,2014,02:78-83.
[25]王玉洁.提高首都经济圈贫困地区居民收入的金融对策研究[D].河北大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[26]石元元.东方蜜蜂遗传图谱构建以及雌性蜜蜂发育分子机理[D].江西农业大学,动物遗传育种与繁殖,2014,博士.
[27]桂翔.基于TF模型的永久可转换债券的博弈定价[D].苏州大学,金融数学,2013,硕士.
[28]张志远.数字化逆变弧焊电源控制器设计与研究[D].复旦大学,电路与系统,2012,硕士.
[29]窦泊言.数术学在VI系统中的应用[D].北京交通大学,2014.
[30]张方方.省级博物馆文化虚拟社区建设思考[D].安徽大学,文物与博物馆,2014,硕士.
[31]董智然.盗窃罪中“扒窃”争议问题研究[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[32]宾宁,李宏,陈松乔.基于SPRINT分类算法的异构分布式数据挖掘研究[J].计算机测量与控制,2005,01:76-78+91.
[33]江志伟.沟槽和植筋新旧混凝土界面抗剪性能试验研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[34]陈凯.分布式系统的性能优化[D].北京交通大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[35]蒋翠.长沙医疗机构公示语英译现状调查及问题解决[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[36]薄颖.全程物流服务下的铁路货运业务流程设计研究[D].北京交通大学,2014.
[37]孙兆辉,连惠婷,孙向英,刘斌.石墨烯掺杂对分子印迹电化学传感器的增敏作用[J].华侨大学学报(自然科学版),2012,04:401-407.
[38]鲍月,徐猛,高自友.基于均值-超量系统总阻抗的随机拥挤收费模型[J].管理科学学报,2015,01:32-40.
[39]李佩东.乌司他丁对小鼠肝热缺血再灌注损伤的影响[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[40]王光.Z公司D项目物流管理优化研究[D].北京交通大学,2013.
[41]王蕾.我国会计诚信缺失及其伦理治理[D].河北大学,伦理学,2014,硕士.
[42]于之宽.优势视角下社会工作对流动儿童同伴关系的介入研究[D].华中科技大学,社会工作,2013,硕士.
[43]钟陈.电容层析成像系统图像融合及成像算法研究[D].哈尔滨理工大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[44]黄柳.基于碰撞模型的ADS-B间隔研究[D].中国民用航空飞行学院,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[45]许绍斌.嵌入式环境下基于AODV协议的无线自组织网络互连研究[D].合肥工业大学,信息管理与信息系统,2013,硕士.
[46]王轶菲.对《法国中尉的女人》的后现代主义解读[D].对外经济贸易大学,英语,2004,硕士.
[47]谢思明.中央苏区时期思想政治教育研究[D].西南交通大学,马克思主义理论,2014,硕士.
[48]温声明,丁长辉,刘兴晓,许怀智,王贵重.塔里木盆地塔东南地区构造特征[J].石油地球物理勘探,2005,S1:19-24+138.
[49]黄小霞.抗混叠移不变Contourlet变换及其在图像处理中的应用研究[D].宁波大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[50]郝少飞.新型多肽RADA16-P24-PLGA共聚物体内诱导成骨的研究[D].华中科技大学,外科学,2013,硕士.