TLR3配体Poly-IC后处理对脑缺血再灌注损伤的治疗效应及其机制研究

【摘要】背景与目的：缺血性脑卒中是由脑部血液循环障碍导致局部神经功能缺失为特征的一组疾病，是目前严重威胁人类健康的最主要疾病之一，是当今世界最主要致残和第二大致死疾病。虽历经多年研究，目前有询证医学证据支持有效的治疗方法是发病后3-4.5h的静脉溶栓，但受有限时间窗及医疗条件的限制，很少有卒中患者能得到这种治疗措施，因此深入研究有效的防治脑卒中的的方法尤为重要，有重要的临床意义。现在认为脑卒中有效治疗方法的匮乏主要原因是卒中的病理生理机制尚不完全清楚。近年来研究发现炎症反应在脑缺血继发性脑损伤中扮有重要作用。天然免疫系统是细菌感染或组织损伤诱导炎症的主要贡献者。现已明确TLRs是天然免疫及PRR家族最重要的模式识别受体之一，主要识别细胞外的病原微生物和细胞内的吞噬体和溶酶体。现有明确的证据表明，TLRs还能识别组织损伤释放的内源性分子，称之为损伤相关的分子模式（DAMPs），从而启动TLRs信号通路，诱导炎症反应。TLRs由N端重复的亮氨酸和Toll/IL-1R的跨膜区域构成。到现在为止，人类已发现11个TLRs，而小鼠发现13个TLRs，不同的TLRs识别不同的病原微生物分子模式和自身组织分子。比如，TLR2以及它的异源二聚体TLR1/TLR2、TLR6/TLR2识别细菌和支原体的脂蛋白，TLR3识别病毒双链RNA，TLR4识别革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分脂多糖（LPS）,TLR7识别RNA病毒的单联RNA，TLR9识别细菌或病毒未甲基化的DNA。TLRs表达在各种不同的免疫细胞，比如中性粒细胞、树状突细胞、巨噬细胞、B细胞、小胶质细胞，而且TLRs还表达在非免疫细胞上，比如纤维母细胞、上皮细胞、角质细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞。TLRs识别病原相关分子模式或损伤相关的分子模式，启动TLRs通路，诱导炎症反应。现已证实TLRs介导的炎症反应在脑缺血再灌注损伤方面扮有重要的的角色。通过识别缺血损伤神经元释放的DAMPs，激活TLRs受体，诱导NF-κB依赖的促炎细胞因子和/或干扰素调节因子的Ⅰ型干扰素，参与病理生理过程。最近的研究表明，缺血脑组织TLR4mRNA的表达明显上调，而且，脑缺血损伤的神经元产生内源性配体可以激活TLR4，通过MyD88依赖性信号途径激活NF-κB转录，产生促炎因子引起神经元的变性、凋亡和坏死。我们和其他实验室发现，在局灶性MCAO和全脑缺血再灌注损伤模型，TLR4缺陷的小鼠可减小脑梗死体积、减轻脑水肿、降低外周血细胞因子TNF-α、IL-6的水平以及改善神经功能评分。最近的研究显示，修饰TLRs介导的NF-κB信号通路，可以减轻心脏、脑等器官的缺血再灌注损害。近年来发现TLR（2，4，7，9）配体的预处理，可以增加脑组织对再次缺血的耐受，显著减小脑梗塞体积，减轻神经功能缺损。而且，TLR2配体Pam3csk4后处理也能减轻脑缺血再灌注损害。TLR3受体识别病毒双链RNA，还可以识别poly-IC，双链RNA模拟物。TLR3被激活后募集调节蛋白TRIF，激活TRIF依赖的信号通路诱导IFNs和NF-κB的激活。与野生鼠相比，TLR3敲除鼠没有减小脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积，显示TLR3不直接参与TLRs通路激活导致的炎症反应。近期有报道TLR3配体poly-IC预处理对缺血性脑和肾脏再灌注损伤有保护作用，但TLR3配体poly-IC后处理是否有效及机制尚不清楚。已有报道TLR3配体poly-IC预处理可以下调巨噬细胞TLR4的表达，抑制LPS诱导的P38-MAPK、PSAPK/JNK信号通路，降低细胞因子TNF-α的水平，从而减轻LPS诱导的肝损害。因此我们主要推测TLR3配体Poly-IC后处理对脑缺血再灌注损伤的也有保护作用，其机制可能通过激活TLR3受体下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路而产生脑缺血保护作用。我们应用大脑中动脉阻塞（MCAO）小鼠、大鼠模型；离体细胞培养（OGD）模型，评价TLR3配体poly-IC后处理对脑缺血再灌注损伤的治疗效果及机制。方法：第一部分：Poly-IC对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1.建立小鼠MCAO模型，应用TTC染色，检测poly-IC预处理，特别是后处理对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护效应，同时检测脑含水量和神经功能评分。2.野生小鼠MCAO48h后，应用尼氏染色及透射电镜，检测各组海马神经元及线粒体的损伤程度；利用ELISA，检测缺血脑组织、脑脊液和外周血细胞因子TNF-α、IL-1β及IFN-β的水平。3.野生小鼠MCAO48h后，利用Westernblot技术，检测缺血脑组织的Bcl-2、Bax、Hsp27及Hsp70的表达；利用免疫荧光技术，检测缺血脑组织的TUNEL及FIB阳性细胞。第二部分：Poly-IC通过TLR3下调TLR4信号产生脑缺血保护效应1.TLR3-/-小鼠MCAO48h后，利用TTC染色及神经功能评分，观察poly-IC后处理对缺血再灌注损伤的效应；利用免疫荧光技术，检测缺血脑组织的TUNEL及FIB阳性细胞数。2.野生小鼠MCAO48h后，利用Westernblot及EMSA技术，检测poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信号分子对TLR4通路的影响；利用ELISA技术，检测poly-IC治疗对LPS刺激小鼠TNF-α及IL-1β水平的影响。3.TLR4-/-小鼠MCAO48h后，利用TTC染色及神经功能评分，观察poly-IC后处理对缺血再灌注损伤的效应。野生小鼠MCAO48h后，利用TTC染色、Westernblot及EMSA技术，检测脑室注射IFN-β对脑缺血的保护效应及对TLR4信号的影响。第三部分：Poly-IC通过TLR3下调小胶质细胞TLR4信号，对海马神经元产生保护效应1.建立离体细胞培养糖氧剥离（OGD）模型，利用ELISA技术，检测各组小胶质细胞分泌的TNF-α、IL-1β及IFN-β的水平；利用免疫荧光技术，检测poly-IC对transwell海马神经元生存率的影响；利用Westernblot技术，检测混合神经元-胶质细胞Bcl-2、Bax的表达。2.小胶质细胞OGD24h后，利用Westernblot及EMSA技术，检测poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信号分子对TLR4通路的影响；利用ELISA技术，检测poly-IC治疗对LPS刺激小胶质细胞TNF-α及IL-1β水平的影响。3.小胶质细胞OGD24h后，利用Westernblot及EMSA技术，检测封闭TLR3信号后，TLR4信号通路的变化。而且检测外源性IFN-β对TLR4通路的影响。第四部分：Poly-IC对小鼠脑缺血再灌注损伤产生长期保护作用1.建立小鼠MCAO模型，利用TTC染色及神经功能评分，检测poly-IC的长期脑缺血保护效应。2.建立大鼠脑永久脑缺血模型，利用TTC染色及神经功能评分，检测poly-IC对大鼠脑缺血的保护效应。结果：第一部分：Poly-IC对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1．利用小鼠MCAO模型，poly-IC预处理能减小脑梗塞体积、减轻脑水肿及改善神经功能评分；重要的是，poly-IC后处理对小鼠脑缺血再灌注损害损害有治疗效应。2.尼氏染色显示，缺血再灌注组海马角1区和齿状回区海马神经元结构严重损害，主要特征是细胞体浓缩伴有细胞核的固缩。然而，poly-IC治疗组，海马神经元的损伤明显减轻。透射电镜显示，缺血再灌注组线粒体外膜严重损害伴有不规则细胞器的形成；与此相对照，poly-IC组线粒体显示基质水肿，但线粒体的完整性保持完整。ELISA结果显示，与缺血对照组相比，poly-IC后处理组缺血脑组织、脑脊液及外周血细胞因子TNF-α及IL-1β的水平明显降低，而IFN-β的水平明显提高。3．Westernblot结果显示，与缺血对照组相比，poly-IC后处理组缺血脑组织Bcl-2、HSP27、HSP70表达显著增高，而Bax水平显著降低；免疫荧光显示，poly-IC后处理组缺血脑组织的的TUNEL及FJB阳性细胞明显减少。第二部分：Poly-IC通过TLR3下调TLR4信号产生脑缺血保护效应1.利用TLR3-/-小鼠MCAO模型，poly-IC的脑缺血的保护效应消失，免疫荧光显示，与缺血对照组相比，poly-IC后处理组缺血脑组织的的TUNEL及FJB阳性细胞没有减少。2.Westernblot及EMSA结果显示，poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3通路的信号分子下调TLR4通路及NF-κB的活性；ELISA结果显示，poly-IC治疗降低LPS刺激小鼠脑脊液及血液中TNF-α及IL-1β的水平。3.利用TLR4-/-小鼠MCAO模型，与缺血对照组相比，poly-IC后处理不能进一步减轻脑缺血损害。野生小鼠MCAO模型，脑室注射IFN-β能减小脑梗塞体积及下调TLR4信号通路。第三部分：Poly-IC通过TLR3下调小胶质细胞TLR4信号，对海马神经元产生保护效应1.利用离体细胞OGD模型，poly-IC治疗降低小胶质细胞分泌的TNF-α、IL-1β的水平，而增IFN-β的水平；免疫荧光结果显示，poly-IC提高transwell海马神经元生存率；与OGD对照组相比，poly-IC治疗组Bcl-2的表达明显增高，而Bax的表达降低。2.利用小胶质细胞OGD模型，poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信号分子下调TLR4通路及NF-κB的活性；Poly-IC治疗减少LPS刺激小胶质细胞TNF-α及IL-1β的生成。3.利用小胶质细胞OGD模型，封闭TLR3信号后，poly-IC下调TLR4信号及NF-κB活性的效应消失；外源性IFN-β可下调TLR4信号通路及NF-κB的活性。第四部分：Poly-IC对小鼠脑缺血再灌注损伤产生长期保护作用1.小鼠MCAO模型，TTC染色及神经功能评分显示，poly-IC减小缺血后14天的脑梗塞体积及改善神经功能评分。2.大鼠脑永久脑缺血模型，与缺血对照组相比，poly-IC治疗组脑梗塞体积减小，神经功能评分改善。结论：1，Poly-IC预处理能减轻局灶性脑缺血再灌注损伤；重要的是，Poly-IC后处理对脑缺血再灌注损伤有治疗效应；而且poly-IC治疗降低缺血脑组织、脑脊液及外周血中TNF-α及IL-1β的水平，增加IFN-β的水平，提示促炎因子TNF-α及IL-1β的减低和抑炎因子IFN-β的增高在poly-IC脑缺血保护中具有重要作用。2，Poly-IC治疗增加缺血脑组织Bcl-2、Hsp27、Hsp70的水平，降低Bax水平，减少缺血区变性、凋亡细胞，提示poly-IC脑缺血再灌注损伤的治疗效应与其抗凋亡及Hsp27、Hsp70的保护作用有关。3，Poly-IC治疗降低OGD小胶质细胞TNF-α及IL-1β的水平，而增加IFN-β的水平，并且提高海马神经元的生存率，提示poly-IC减轻小胶质细胞炎症反应，产生海马神经元保护效应。4，TLR3敲除后，poly-IC脑缺血保护效应消失，提示poly-IC通过TLR3介导脑缺血保护作用。5，Poly-IC通过TLR3下调TLR4信号通路，对脑缺血再灌注损伤产生保护效应。6，Poly-IC对小鼠脑缺血再灌注损伤具有长期保护效果应及对大鼠永久性脑缺血损伤产生保护作用。
【作者】王鹏飞；
【导师】杨清武；
【作者基本信息】第三军医大学，神经病学，2014，博士
【关键词】TOLL样受体4；聚肌胞酸；缺血再灌注；TOLL样受体3；TOLL样受体4信号；

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