富含功能蛋白的冻干组织工程骨的构建及成骨效果与成骨机制的研究

【摘要】研究背景及目的：目前临床对骨修复材料有着巨大需求，并且日益增长，但是现在的研究进入了瓶颈期。在组织工程骨的三要素中均存在很多问题导致研究停滞不前，将构建好组织工程骨植入体内首先面对的是其血管化问题，研究发现组织工程骨植入体内后因营养物质及氧气的缺乏，导致种子细胞的大量死亡；而因子的应用可以避开血管化问题带来的困扰，但是面对体内复杂的成骨内环境及成骨因子让我们无从下手。我们课题组在关注组织工程骨血管化的问题时，也发现将组织工程骨植入体内后种子细胞大量死亡，但是一个较为奇怪的现象是组织工程骨的成骨效果非常好，甚至接近自体骨的水平，这与许多研究者的结果一致。给我们的提示是死亡的种子细胞是不是在后来的骨修复中发挥着积极的作用？目前的研究发现MSCs可以被称为因子库，因为其分泌大量的细胞因子（生长因子、募集因子、炎性因子等）通过旁分泌或自分泌的方式调控宿主细胞募集、骨发生、血管发生及骨重塑等过程，细胞的裂解液在体外也能刺激细胞的增殖分化。基于以上研究基础，我们设想体外构建的组织工程骨直接冻干将细胞裂解，植入体内后利用各类作用不同的细胞因子间协同作用来促进骨修复。方法：实验一：首先我们选取hUC-MSCs作为我们研究的种子细胞，通过横截面HE染色、免疫荧光染色观察脐带结构及MSCs分布区域，然后有针对性进行分离。为保证快速、有效、规范、质控地分离细胞，我们发明了专用的组织培养皿和反复培养法。将组织块培养皿与普通的培养皿进行对比研究，观察组织块的漂浮数，传代时细胞数等数据。然后将组织块进行反复培养，收获T1-P3,T3-P3和T5-P3hUC-MSCs并通过流式鉴定细胞表面分子，诱导其多向分化等来对反复培养收获的细胞进行鉴定。为验证反复培养细胞的骨修复能力，我们设计了体内、体外实验。体外实验首先比较细胞的增长动力，及经过成骨诱导后RT-PCR检测ALP,RUNX2和OC基因表达水平及蛋白表达水平。体内实验中我们将T1-P3和T5-P3分别构建TEB，然后将其植入到裸鼠的左右侧髂骨表面，观察异位成骨能力，8周后行Micro-CT，HE及Masson染色检测反复培养细胞在体内的成骨能力。实验二：构建FD-TEB并进行体内验证，制作h-DBM，并利用第二章中的方法分离细胞，构建TEB并记录细胞的上架率。通过普通光镜、扫描电镜、激光共聚焦、HE染色观察TEB构建情况，证明种子细胞大量存在于DBM上。将构建的TEB进行深低温冻干，通过扫描电镜观察定性，测量支架材料上不同时间点蛋白总量以确定最佳体外构建时间，Raybiotech蛋白芯片对21种成骨因子及43种募集、炎性细胞因子进行定量，判断各类、各种细胞因子是否存在DBM上。对FD-TEB进行体外缓释实验，观察体外释放过程。体内对FD-TEB的成骨效果进行验证，研究利用裸鼠的股骨半原位实验，将FD-TEB植入裸鼠的左侧股骨旁，TEB植入到右侧股骨旁，在术后3、6、9周Micro-CT检测新骨骨量及新骨骨密度，HE及Masson染色观察新骨的细胞及细胞外基质结构。实验三：在山羊动物模型中验证FD-TEB的成骨效果，分离山羊UC-MSC并进行鉴定，鉴定的方法是流式鉴定表面分子，三系诱导鉴定其多向分化潜能。构建山羊-TEB，普通光镜及扫描电镜观察种子细胞情况，然后将其冻干，扫描电镜判断构建情况。手术在山羊的股骨造2cm骨及骨膜缺损，将FD-TEB及DBM分别植入到山羊左右侧的股骨缺损处。术后2、4周行放射性核素显像，判断股骨缺损处的血液灌注情况。2、4、8、16周X线观察股骨缺损修复的进展情况，8、16周行CT检查，并计算新骨体积及其CT值，比较两侧的骨修复情况。同时行HE、Masson染色观察细胞及细胞外基质形态。术后检测白细胞、肝肾功等检测机体内环境情况。实验四：冻干-TEB与TEB类似有着体内高感染率问题，首先构建冻干TEB，具体方法同第四部分，用万古霉素（浓度为50mg/ml）和藻酸盐（浓度是16%）的溶液制备藻酸盐万古霉素微球，然后放到纤维蛋白原-磷酸二氢钾的混合溶液中搅拌，最后放入到400IU/ml的凝血酶溶液中，使微球的表面形成一层纤维蛋白凝胶，增加微球的缓释时间。将FG-Vanco-AB进行体外缓释实验，检测缓释万古霉素浓度。然后构建抗菌-FD-TEB，体视显微镜进行观察。结果：实验一：组织块培养皿克服了以前分离过程中组织贴壁不牢固，组织利用率低的缺点，培养12天时，实验组无组织块漂浮，而对照组共有13（n=3）块组织漂浮。细胞游出的组织块实验组与对照组是（86±2.7）%VS（44±4）%,n=3;p<0.01，有着明显的统计学差异。12天传代时细胞数量是：（24.7×104±3.6×104）VS（5.1×104±1.0×104）,n=3;p<0.01。经鉴定反复培养的细胞均阳性表达CD44、CD73、CD90、CD105，阴性表达CD34、CD45，能被成功向成骨、成脂、成软骨方向分化。细胞的体外倍增时间均为32h，细胞生长曲线的调整期、指数增长期、平台期基本类似。经体外成骨诱导后ALP，RUNX2和OC基因及蛋白表达水平无明显统计学差异。植入体内8周后，实验组及对照组BV/TV分别是（44.2±5.3）%VS（48.5±4.4）%，BMD是（0.41±0.09）g/cm2VS（0.44±0.08）g/cm2。实验二：在构建TEB的过程中，发现细胞上架率在（82.4±3.3）%左右，普通光镜、扫描电镜、激光共聚焦、HE染色等均发现细胞与支架材料相容性良好，胞浆舒展呈扁平状并随时间进行增殖。在体外的实验中，细胞增殖在10天左右进入平台期，裂解的蛋白量为11991ug/ml，冻干后为7544ug/ml，冻干后蛋白保有率为（0.65±0.03）%（n=8）。在10天时，募集因子、生长因子、炎性因子、成骨因子等均有很高的表达。体外缓释实验中也发现总蛋白在21天时检测还有38ug/cm3。体内实验发现3周时实验组基本修复，而对照组未完成修复，6周实验组的异位BV是0.5±0.13mm3，骨密度是：0.21±0.07g/cm2，对照组未见异位成骨；9周时，实验组的异位出现大量的片状骨化影，而对照组的异位出现较多的骨化影。实验组的异位BV是（1.2±0.26）mm3，而对照的是（0.4±0.18）mm3，骨密度分别是：（0.35±0.11）g/cm2VS（0.27±0.11）g/cm2。实验三：经过鉴定分离的细胞为山羊MSCs，可以分化成骨、脂肪、软骨。光镜及扫描电镜观察TEB及FD-TEB同第三部分实验，细胞及细胞外基质大量的存在于支架材料上，证明FD-TEB构建成功。将其植入到体内后，术后2周血池相左右侧分别为（410±74.5）VS（373±45.8），骨扫描相为（513±62.9）VS（381±64.3），术后4周左右侧的血池相为（559±98.1）VS（378±84.6），骨扫描相为（1349±103.1）VS（870±90.7），左右侧间比较均有着明显的统计学差异。术后8周左右侧新骨体积为（1518±159.8）VS（1039±178.2）（mm3），CT值为（620±68.8）VS（400±86）；术后16周左右新骨体积为（2532±189.3）VS（2421±111.7）（mm3）,CT值为（813±104.8VS（785±118.2），左右侧均有统计学差异。术后白细胞、谷草转氨酶、肌酐、白蛋白均无有意义的变化。实验四：扫描电镜证实FD-TEB构建成功，观察到的情况与之前的类似，冻干后的TEB上见大量隆起的蛋白及细胞外基质。根据优化的方案制作的FG-Vanco-AB在体外缓释实验中万古霉素浓度大于杀菌浓度敏感折点（5mg/ml）的时间为24天。将微球与冻干-TEB附合，可以放入-80℃冰箱中长期保存直到应用。结论：研究总结了一套完整、高效的脐带Wharton’sjelly-MSCs细胞的分离方法，并且通过贴壁培养及反复培养可以最大限度的利用脐带组织。反复培养的细胞经鉴定不但是hUC-MSCs，而且体外、体内在成骨能力方面无明显差异。成功构建冻干-TEB，体外实验中证实有大量的细胞因子存在于支架材料表面，在裸鼠、山羊的体内进行成骨方面的检测，证实其成骨效果明显优于单纯的DBM，说明了冻干后的细胞因子促进了缺损区域的骨修复。成功构建抗菌-FD-TEB并进行了初步的研究，体外实验证实缓释效果良好。
【作者】常正奇；
【导师】许建中；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】脐带间充质干细胞；组织块培养皿；组织工程骨；冻干组织工程骨；抗菌-冻干-组织工程骨；细胞因子；骨缺损；骨修复；

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