菊花转录因子CmbHLH1的克隆及功能鉴定

【摘要】菊花栽培历史悠久,花色丰富,形态多样,是我国十大传统名花和世界四大切花之一,在花卉产业中占有重要地位。转录因子是在基因表达调控过程中起重要作用的蛋白分子,与植物胚的发生与发育、植株生长、细胞分化、形态建成、植物抗性、营养吸收等生命活动都密切相关,是国内外研究的热点之一。bHLH转录因子蛋白因其具有独特的HLH结构域而被分为一类,该类转录因子参与植物生长发育的诸多过程,如色素的合成调控、金属离子吸收、光形态建成等。为此,本研究克隆了菊花bHLH转录因子基因CmbHLHl及其启动子序列,对其组织器官、响应外源生长调节物质及非生物胁迫的表达特性进行了分析,并通过转化菊花‘神马’初步进行了功能鉴定。主要结果如下：本研究利用RT-PCR和RACE等技术克隆了菊花‘钟山紫桂’bHLH转录因子基因的cDNA全长,命名为CmbHLH1。CmbHLHl全长987bp,开放阅读框（ORF）为630bp,编码210个氨基酸,其编码产物含有典型的HLH保守结构域。氨基酸序列比对发现,CmbHLH1与苹果bHLHdomainclasstranscriptionfactor（ADL36593）同源性最高,达到62.98%。系统进化树分析表明,CmbHLH1和拟南芥ILR3（NP200279.1）的亲缘关系比较近。启动子序列顺式作用元件预测分析显示,除具有典型的真核生物核心启动子结构外,还包含多个与胁迫响应和激素应答有关的调控元件,如IDE2、IBOXCORE、MYCCONSENSUSAT、WEKY710S等。荧光定量PCR（qRT-PCR）显示,在低铁离子胁迫处理12h后,‘钟山紫桂’根中CmbHLH1表达水平升高,约在48h时达到最高。在100mg/LABA处理24h内,处理组的CmbHLHl表达量均高于对照组,而在0.5mmol/LSA处理24h内,处理组的CmbHLH1表达量均低于对照组。在MeJA处理与其他非生物胁迫下,处理组的CmbHLH1表达量较对照组没有明显的大幅变化。本研究还构建了CmbHLH1基因植物正反义表达载体,用农杆菌介导的叶盘转化法将CmbHLH1基因转化菊花‘神马’。经潮霉素筛选,鉴定出21个抗性株系,其中14个转正义载体株系,7个转反义载体株系。基因定量分析选取出了2个超表达株系（35S::（+）CmbHLH1-1和35S::（+）CmbHLH1-2）与2个低表达株系（35S::（-）CmbHLH1-1和35S::（-）CmbHLH1-2）。对以上4个株系以及未转基因植株进行缺铁离子胁迫处理与根系pH检测。根系中铁、锌、锰离子含量测定表明,超表达CmbHLH1基因能促进根系对铁离子的吸收,而对锰、锌的作用不明显。pH检测结果表明超表达株系能够显著提高根系酸化能力。综上所述,推断该转录因子CmbHLH1可能参与调控菊花对铁离子的吸收。
【作者】赵民；
【导师】陈发棣；
【作者基本信息】南京农业大学，园林植物与观赏园艺，2013，硕士
【关键词】菊花；转录因子；表达分析；CmbHLH1；铁离子；

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