ARHGEF5基因在NSCLC增殖、侵袭和转移中的作用及其机制的研究

【摘要】研究背景：肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的肿瘤，80%以上为非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）[1]；。虽然针对NSCLC的临床治疗有了一些进展，但还是以外科手术、化疗和放疗为主，目前，NSCLC的5年生存率仅仅10-15%。最近，针对NSCLC的肿瘤信号分子的研究，包括EGFR、Notch3和Wnt信号通路获得了较大的进展。但是，由于目前对肺癌发生发展的具体机制还并不清楚，仍然缺乏敏感和特异的肿瘤分子标记用以评价患者的预后，以及作为可能的分子靶点。所以，筛选、鉴定与肺癌相关的基因和蛋白，并深入研究其与肺癌发生发展的相关性及分子机制，是肺癌研究领域的一个重要方向。Src是一个特别有希望的抗癌分子靶点，它通过p190RhoGAP和黏着斑激酶的磷酸化调控细胞骨架的重组，调节细胞黏附和运动，从而在肺癌侵袭转移中发挥了重要作用[2]。虽然src抑制剂Dasatinib已经进入了Ⅲ期临床实验，但是仍需配合EGFR等分子的抑制剂，才能达到预期的效果[3]。从而提示：src下游的关键信号蛋白及其信号传导通路需要进一步的研究探索。ARHGEF5（Rhoguaninenucleotideexchangefactor5）是鸟嘌呤核苷酸交换因子（guaninenucleotideexchangefactorsfamily,GEFs）中Dbl家族成员之一[4]。其基因定位于人类染色体的7q33-q35[5]，编码的的蛋白有重链和轻链两种亚型，由一条mRNA编码，均由DH区、PH区、SH3域以及C端的脯氨酸构成。轻链含有519个氨基酸，分子量为60KDa；重链含有1597个氨基酸，分子量约为170200KDa。短链亚型最初是从人乳腺癌细胞株中鉴定分离出来，命名为TIM（TransformingImmortalizedMammary）[1]。有人发现TIM的突变剪接体在乳腺癌细胞转移中扮演了重要的角色[2]。最近有篇文献报道了ARHGEF5重链亚型作用特点，即ARHGEF5重链亚型可以被src激活，并在伪足形成中发挥了重要作用，过表达的ARHGEF5重链亚型通过活化RhoA，促进了肌动蛋白张力丝重塑。而src诱导伪足小体结构RhoA或Cdc42的活化[3]。既往的研究仅着眼于细胞骨架改变、伪足的形成等表观现象，而对该信号通路可能的下游信号传导，以及导致肿瘤侵袭转移的机制，尚无相关报道。增殖、粘附、侵袭和转移是原癌基因的致瘤特点。尽管ARHGEF5基因鉴定为原癌基因，但是在相关肿瘤中的研究较少。这是因为ARHGEF5所在的Dbl家族有70多个成员，绝大多数功能不明。但是Dbl家族蛋白所属的GEFs家族，目前已经越来越受到重视，并成为癌症靶向治疗的热点。ARHGEF5是从乳腺癌细胞中分离，它的突变剪接体在乳腺癌细胞中发挥了重要作用，但在人NSCLC中的表达、作用及机制目前国内未见报道，国外少有文献报道。因此，本研究结合临床资料，应用基因沉默及体内外实验等研究方法，从人群、体外NSCLC细胞和裸鼠体内水平探讨ARHGEF5基因在NSCLC发生发展中的作用及其机制，有望为NSCLC的诊断和治疗提供新的靶点和新的理论依据。研究目的：揭示ARHGEF5基因对NSCLC增殖、侵袭和转移的致瘤作用，并探讨ARHGEF5在NSCLC发生、发展中的作用及其可能的机制，为深入理解ARHGEF5在NSCLC中的作用进行初步探索，以期为NSCLC新的诊断和治疗方法提供研究基础。研究方法：1.ARHGEF5在NSCLC中的表达及其作用应用免疫组化检测193例NSCLC癌组织及其对应的远癌组织中ARHGEF5和src蛋白的表达、WesternBlot检测了4例肺鳞癌和肺腺癌组织、5种NSCLC细胞株和HBE中ARHGEF5蛋白的表达，同时运用免疫荧光检测人NSCLC组织中ARHGEF5和src的共表达。2.ARHGEF5基因沉默对NSCLC细胞株增殖、侵袭转移等特性的影响，以及相关信号通路的初步探讨根据ARHGEF5基因在人NSCLC细胞株中的表达情况，选择ARHGEF5中度表达、具有一定成瘤及转移能力的A549和NCI-H1650细胞株，将ARHGEF5siRNA转染A549和NCI-H1650细胞株，24hr后采用RT-PCR及Westernblot方法鉴定转染后ARHGEF5基因在细胞中的表达情况并进行体外实验的功能验证，包括细胞的增殖、凋亡、细胞周期的改变，以及粘附、侵袭和迁移。运用免疫荧光双标记法、免疫共沉淀技术，验证人NSCLC细胞中src和ARHGEF5的共定位表达，以及物理性的结合。WesternBlot、PCR法检测下游效应蛋白的表达。利用文献及上述实验结果，推测ARHGEF5下调后可能的靶蛋白，并从中选取与增殖、侵袭转移特性密切相关的CyclinD1和MMPs蛋白进行验证。3.ARHGEF5在裸鼠体内作用的初步探讨根据ARHGEF5（NM005435.3）靶基因序列，构建RNA干扰慢病毒载体。用含ARHGEF5干扰序列的慢病毒感染A549细胞，同时设置慢病毒阴性对照组和空白对照组。建立慢病毒载体转染的A549细胞的裸鼠皮下移植瘤模型。通过建立动物模型，体内研究ARHGEF5对NSCLC细胞的影响。结果：1.NSCLC组织和细胞株中ARHGEF5的表达。免疫组化结果表明：ARHGEF5在大多数肺癌组织中呈现出阳性表达：阳性率为68.91%（69/193）。其中腺癌68.09%（64/94），鳞癌69.70%（69/99），而在对应的远癌组织中几乎全部为阴性表达。WesternBlot结果也发现ARHGEF5在正常人支气管上皮细胞HBE中低表达，在5种NSCLC细胞株中高表达。ARHGEF5阳性染色与年龄、分化、肿瘤分期具有显著性差异（p<0.05）；而与病理类型、性别、淋巴结转移无统计学差异。ARHGEF5与src在腺癌组织中的共表达率明显高于鳞癌，相关性有显著差异（p<0.05）2.ARHGEF5基因沉默对NSCLC细胞增殖、粘附、侵袭迁移的影响，以及可能的信号通路成功将ARHGEF5siRAN瞬时转染人NSCLC细胞株（A549和NCI-H1650），明显下调了ARHGEF5蛋白的表达；将含ARHGEF5siRNA转染A549和NCI-H1650细胞，可以降低肺癌细胞的增殖、粘附、侵袭和迁移，但是对细胞凋亡无明显影响。初步探讨了可能激活的靶蛋白及其相关的信号通路，发现下调ARHGEF5基因在A549和NCI-H1650细胞中的表达后，均可以在蛋白水平显著降低p-src、p-Akt、NF-κB、CyclinD1和MMP2的表达；PCR检测CyclinD1和MMP2mRNA也明显降低。3.沉默ARHGEF5基因抑制了A549细胞皮下移植瘤的生长成功构建了ARHGEF5基因下调表达的慢病毒载体，建立了稳定下调ARHGEF5基因的A549细胞株。随后将感染了慢病毒的A549细胞皮下注射裸鼠，建立皮下移植瘤模型。在裸鼠模型上，干扰ARHGEF5的慢病毒在稳定筛选的细胞中有效的下调了ARHGEF5蛋白的表达，并能有效的抑制人肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长。结论：1.在NSCLC手术切除患者中，ARHGEF5的表达，与患者的年龄、肿瘤分期和分化密切相关（p<0.05）。并且肺腺癌中，ARHGEF5与src共表达的相关性显著高于肺鳞癌（p<0.05）。2.原癌基因ARHGEF5可以促进人NSCLC细胞系A549细胞和NCI-H1650细胞的增殖、粘附、侵袭和迁移。3.ARHGEF5参与NSCLC的可能机制是：通过上调p-Akt、NF-κB信号通路，提高了肿瘤细胞CyclinD1及MMP2的转录活性，以及相应蛋白的表达。从而加快细胞的增殖和细胞外基质的降解。4.下调ARHGEF5的A549细胞，移植到裸鼠皮下导致肿瘤生长缓慢，再次验证了ARHGEF5的致瘤性。
【作者】何萍；
【导师】杨康；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】NSCLC；ARHGEF5；增殖；侵袭迁移；

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