Wnt5a信号通路在结肠癌血管生成拟态及EMT中的作用

Wnt5a信号通路在结肠癌血管生成拟态及EMT中的作用

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-14 分类:文献综述 喜欢:3231
师大云端图书馆

【摘要】研究背景和目的:结肠癌是世界范围内发病较为广泛的恶性肿瘤之一,肿瘤的转移和复发严重威胁结肠癌病人的生命。肿瘤的生长以及转移需依赖肿瘤组织中的血管生成。血管生成拟态(vasculogenicmimicry,VM)是一种不依赖内皮细胞的全新肿瘤微循环模式,已有研究报道发现多种恶性肿瘤中存在VM,如肝癌、前列腺癌、卵巢癌等。前期研究结论证实结肠癌中存在VM,且VM与肿瘤的恶性度相关,与临床不良预后有关。结肠癌中VM的详细形成机制至今不明,已有研究结果证实上皮间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)以及经典Wnt/β-catenin信号通路的过度活化在结肠癌VM形成中起重要作用。本课题组前期研究己发现在结肠癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的过度活化并且参与启动EMT。已有研究报道称非经典Wnt信号通路可促进肿瘤细胞迁移,通过激活转录因子启动EMT。非经典Wnt信号通路中最重要的Wnt分泌蛋白Wnt5a在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等中存在促进肿瘤的侵袭和转移的作用,Wnt5a可促进多种肿瘤细胞发生EMT。而非经典Wnt信号通路在结肠癌中的作用研究却相对甚少且不一致,因此我们遴选非经典Wnt信号通路中Wnt5a作为研究对象,探讨Wnt5a信号通路在结肠癌VM形成机制中可能存在的作用。本研究利用免疫组化技术初步分析了217例结肠癌病例组织中Wnt5a的表达情况,并结合前期实验结果进一步探讨Wnt5a与EMT相关蛋白以及VM形成的关系,并利用细胞转染技术、分子生物学技术及免疫缺陷小鼠肿瘤细胞移植瘤模型进一步探究Wnt5a对结肠癌细胞EMT及VM形成的影响,以期阐明非经典Wnt信号通路在结肠癌中的作用。研究方法:1)免疫组织化学染色方法检测217例结肠癌组织标本中Wnt5a的表达,并结合临床病理资料以及生存情况随访记录结果,分析Wnt5a的表达与临床病理特征的关系以及Wnt5a的表达与患者生存预后的关系。结合前期试验结果,分析Wnt5a的表达与结肠癌中EMT相关蛋白E-cadherin以及Vimentin的关系,以及与结肠癌中经典Wnt/β-catenin信号通路关键调控蛋白β-catenin的关系。2)建立异常Wnt5a基因表达的结肠癌细胞系,验证Wnt5a基因过表达以及降表达效果,筛选稳定过或者降表达Wnt5a的结肠癌HCT116细胞。3)WesternBlot以及免疫荧光检测Wnt5a对结肠癌EMT以及经典Wnt/β-catenin信号通路的影响。4)MTT实验以及软琼脂克隆形成实验验证Wnt5a对HCT116细胞增殖能力的影响作用;划痕实验以及侵袭实验检测Wnt5a对HCT116细胞运动迁移以及侵袭能力的影响;细胞粘附实验检测Wnt5a对细胞粘附的作用。5)动物实验体内检测Wnt5a对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响,并以免疫组化染色方法检测移植瘤中EMT相关蛋白的表达。6)细胞流式术检测Wnt5a对结肠癌细胞内钙离子浓度的影响作用。7)通过细胞三维培养技术检测Wnt5a对结肠癌细胞成管能力的影响,并通过Real-timePCR以及WesternBlot检测Wnt5a对血管生成相关蛋白的作用。结果:1.Wnt5a在结肠癌中表达下降,Wnt5a阳性表达与患者的良好临床预后有关。Wnt5a的表达与结肠癌EMT相关蛋白呈负性相关关系。Wnt5a可能通过抑制经典Wnt/β-catenin言号通路活化来抑制EMT。Wnt5a在VM阴性患者的表达比率较高,提示Wnt5a可能抑制结肠癌中VM的形成。2)Wnt5a在结肠癌细胞系中普遍呈低表达状态,成功构建基因调控Wnt5a表达的结肠癌HCT116细胞。3)Wnt5a可通过下调EMT相关的转录因子抑制结肠癌细胞EMT过程,结肠癌细胞系HCT116中过表达Wnt5a后可拮抗经典Wnt/β-catenin信号通路。4)Wnt5a过表达可明显抑制HCT116细胞的增殖;Wnt5a可抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力;Wnt5a可增强细胞粘附能力。5)Wnt5a抑制体内小鼠体内移植瘤的生长,且抑制瘤体组织中EMT相关蛋白的表达。6)Wnt5a可促进细胞内钙离子浓度升高,从而激活Wnt/Ca2+信号途径。7)Wnt5a抑制HCT116细胞管道样结构的形成能力,并抑制促血管生成因子蛋白水平的表达。结论:Wnt5a作为抑癌基因在结肠癌中呈普遍性低表达或者失表达,Wnt5a的阳性表达与结肠癌良好的临床预后相关。Wnt5a可拮抗经典Wnt/β-catenin信号通路及与之有关的EMT过程。Wnt5a可通过激活Wnt/Ca2+信号途径操控促进凋亡蛋白Bax的表达,抑制细胞生长。Wnt5a抑制细胞的侵袭迁移能力并抑制VM形成。
【作者】程润芬;
【导师】孙保存;
【作者基本信息】天津医科大学,肿瘤学,2014,博士
【关键词】结肠癌;血管生成拟态;Wnt5a;上皮间充质转化;Wnt/Ca2+信号通路;

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