PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究

【摘要】研究目的研究前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen,PSMA)在肺癌组织的肿瘤细胞和血管内皮细胞上的表达情况。分析PSMA在肺癌中表达情况与患者的年龄、性别、病理类型、肿瘤大小、临床分期等因素的关系。构建AAV/PSMA质粒,制备AAV/PSMA病毒,用AAV/PSMA病毒转染树突状细胞,诱导生成细胞毒性T淋巴细胞。研究方法1.从天津医科大学附属肿瘤医院标本库选取非小细胞肺癌标本87例(包括鳞癌30例、腺癌29例、大细胞癌28例),小细胞肺癌30例,正常肺组织标本33例。这些标本同时用PSMA抗体和CD31抗体进行了免疫组化。免疫组化的阳性对照选择前列腺癌组织,阴性对照选用PBS。2.复苏培养扩增高表达目的基因PSMA的LNcap细胞。用Trizol法从高表达目的基因的LNcap细胞中提取总RNA。用mRNA抽提试剂盒从总RNA中抽提mRNA。RT-PCR方法将mRNA逆转录为cDNA并将逆转录的cDNA进行扩增。利用QIAGEN公司的凝胶抽提试剂盒抽提凝胶中的目的基因。用T4连接酶将目的基因与腺相关病毒载体进行连接。将连接产物与感受态细胞混合进行转化和涂菌。挑选生长良好的单克隆菌落用LB培养基进行扩增培养。单克隆菌落扩增之后进行质粒抽提。抽提的AAV/PSMA质粒分别用PCR和基因测序两种方法进行验证并与GenBank公开的PSMA序列对比吻合。无腺病毒参与的包装系统制备AAV/PSMA病毒。3.AAV/PSMA转染DC并诱导生成CTL取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞PBMC。取无菌10cm培养皿,按约8×107-12×107个细胞/皿,将PBMC加入培养皿中,补充AIM-V培养液。置二氧化碳培养箱培养,37℃,5%CO2,3小时。3小时后加入AAV/PSMA病毒,继续培养8小时。8小时后将悬浮的T淋巴细胞转移至T75或以上的细胞培养瓶中。根据悬浮细胞密度,决定需要培养液体积和细胞培养瓶的数量。培养瓶中加入细胞因子白介素-2,置二氧化碳培养箱中,37℃,5%CO2培养。培养皿底部贴壁细胞为树突状细胞。培养皿中加入AIM-V培养基、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4。第六天将DC和淋巴细胞混合培养(DC：淋巴细胞为1：20)。混合培养阶段应每天在倒置显微镜下观察细胞集落情况,若观察到细胞集落稍有松散,则可判定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)已经被激活,CTL细胞培养完成。流式细胞仪检测树突状细胞的表型CD83、CD80和CD86;CTL抗肿瘤杀伤活性的检测：用带荧光标记的CD4、CD8、CD25、CD69抗体标记CTL细胞,以流式细胞仪进行检测,得到所培养的CTL细胞中CD4+CD8+、CD25+CD4+、CD69+CD8+的表达情况；用FITC-anti-IFN-γ标记CTL,以流式细胞仪检测,得到CTL细胞中IFN-γ的表达情况。用不同MOI的病毒转染DC并用流式细胞仪进行检测,得至AAV/PSMA病毒转染DC的最佳MOI数值。研究结果1.在非小细胞肺癌中,PSMA在肿瘤细胞上的阳性表达率为54.02%,在肿瘤血管内皮细胞上的阳性表达率为85.06%；在小细胞肺癌中,肿瘤细胞上没有PSMA阳性表达,在肿瘤血管内皮细胞上PSMA阳性表达率为73.33%；在与肿瘤相邻的正常肺组织上没有发现PSMA表达。2.成功构建AAV/PSMA质粒并制备AAV/PSMA病毒；经PCR验证,构建的质粒中成功插入PSMA基因,长度为720bp；树突状细胞中CD80、CD83和CD86的表达比例分别为54%、83%和72%；CTL中CD8/CD4为1.12,CD25+CD4+、CD69+CD8+和IFN-γ的表达分别为9.052%、42.76%和39%。研究结论PSMA特异性的表达于非小细胞肺癌的肿瘤细胞和血管内皮细胞；PSMA特异性表达于小细胞肺癌的肿瘤血管内皮细胞而不表达于肿瘤细胞；与肿瘤相邻的正常肺组织无PSMA表达；PSMA可能成为肺癌早期筛查的新标志物和治疗新靶点。以AAV为载体介导抗原基因PSMA转染DC可以成功诱导生成细胞毒性T淋巴细胞,PSMA作为肿瘤相关抗原在肺癌免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。
【作者】王海龙；
【导师】郭志；
【作者基本信息】天津医科大学，肿瘤学（专业学位），2014，博士
【关键词】肺癌；前列腺特异性膜抗原；树突状细胞；腺相关病毒；免疫治疗；

【参考文献】
[1]张聪.从歌剧《原野》中探索金湘的“歌剧思维”[D].河北师范大学,音乐学,2012,硕士.
[2]王聪.四川烟区烟叶质量与经纬度的相关性研究[D].河南农业大学,烟草学,2012,硕士.
[3]王玲玲.新课改背景下高中语文课堂小组合作学习有效性研究[D].辽宁师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[4]林萌.基于平衡记分卡的教育游戏评价指标体系的构建[D].云南师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[5]田军.国际EPC工程成本控制模式研究[D].燕山大学,项目管理,2014,硕士.
[6]特格其白乙.蒙古语《HAR_A》一词构成的复合名词结构语义研究[D].内蒙古师范大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[7]曾华圣.无线传感器网络非均匀分簇路由算法研究[D].重庆大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[8]王聪颖.复方目炎宁加减治疗前葡萄膜炎的临床评价研究[D].黑龙江中医药大学,中医五官科学（专业学位）,2014,硕士.
[9]陈永琳.县级高中利用多媒体辅助英语教学的现状与对策[D].华中师范大学,学科教学,2012,硕士.
[10]张阳.大相国寺仪式音乐研究[D].天津音乐学院,艺术学,2013,硕士.
[11]张啟.出口脱皮花生仁加工与贮藏研究[D].江西农业大学,农产品加工及贮藏工程,2012,硕士.
[12]王瑞芳.新时期我国政府海洋科技管理创新的研究[D].浙江海洋学院,农业推广（专业学位）,2013,硕士.
[13]王利锋.喷墨打印用陶瓷表面装饰墨水的制备及其性能分析[D].天津大学,化学工程,2013,硕士.
[14]石明.数据挖掘技术及其在邮政客户关系管理系统的应用[D].西安电子科技大学,2003.
[15]王艳萍.道路遥感灾情识别技术及震灾救援运输优化研究[D].中国矿业大学（北京）,地球探测与信息技术,2014,博士.
[16]成兴华.FT-XDSP高性能64位定点SIMD乘加部件的设计与实现[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[17]常磊.污泥活性炭制备及吸附二氧化硫气体的研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2013,硕士.
[18]董学启.以农村义务教育学校为主的教师文化建设研究[D].云南大学,公共管理,2012,硕士.
[19]陈鑫.南京三所典型高校新老校区景观格局与绿地空间布局的比较研究[D].南京农业大学,城市规划与设计,2012,硕士.
[20]陈健.女子花样滑冰专项速度训练方法研究[D].吉林体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[21]刘杰.农业劳动力素质对农业技术效率的影响研究[D].西安工业大学,区域经济学,2014,硕士.
[22]冯士东.非晶态Zr基二元合金微观结构与力学性能内在关联性研究[D].燕山大学,材料学,2013,硕士.
[23]记者王宙洁.碳系家族开启“新黑金时代”[N].上海证券报,2014-02-28A08.
[24]黄洪添.《东西晋演义》人物形象研究[D].华中科技大学,古代文学,2013,硕士.
[25]杨爽风.异穿心莲内酯衍生物的合成[D].天津医科大学,药物化学,2009,硕士.
[26]王晓芍.风力压缩空气式苦咸水淡化试验研究[D].山东大学,流体机械及工程,2013,硕士.
[27]晏江.轻型快速卸煤机械研究[D].西南交通大学,机械工程,2014,硕士.
[28]赵光明.回阳生肌膏对糖尿病皮肤溃疡大鼠血管生成相关因子影响的实验研究[D].北京中医药大学,中医外科学,2014,硕士.
[29]张晓娟.自平衡式索托结构关键问题研究[D].北京交通大学,结构工程,2013,硕士.
[30]薛生杰.大功率LED散热用陶瓷金属基板的制备与性能研究[D].重庆大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[31]吴丽丽.当代男性作家作品中的儿童视角[D].安徽大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[32]乔峰.Ag、石墨烯纳米流体的制备及性能研究[D].青岛科技大学,2010.
[33]王广民,高自友,徐猛,孙会君.弹性需求下网络设计问题和电子路票问题研究[J].管理科学学报,2015,04:38-48.
[34]王晓燕.投射模的两类推广形式[D].安徽大学,基础数学,2013,硕士.
[35]周晗.离心辅助微模塑法制备金属微器件[D].兰州理工大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[36]高娇娇.网助翻译与技术文本汉译英[D].天津理工大学,英语笔译,2013,硕士.
[37]史志远.模具设计中的CAE技术[J].机电信息.2002(05)
[38]潘翔,陈敖,章国栋.结合统计分类和边缘特征的最优视图提取[J].中国图象图形学报,2013,08:1004-1010.
[39]居胜峰.基于主动学习的情感分类方法研究[D].苏州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[40]周锋.大断面浅埋暗挖隧道施工方法及其稳定性研究[D].西安建筑科技大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[41]徐慧.对外汉语教学中同素逆序词教学研究[D].南京大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[42]卢沛洪.ZnO/p-Si异质结制备优化及光电性能研究[D].广东工业大学,材料学,2013,硕士.
[43]杨娜.金属掺杂TiO_2柱撑蒙脱土光催化降解酸性橙[D].西北大学,化学工程（专业学位）,2012,硕士.
[44]牙克甫江·买买提（Yakupjan·Mamat）.新疆维吾尔自治区政府门户网站信息公开问题研究[D].长安大学,行政管理,2014,硕士.
[45]康春华.数学研究性学习的探索与实践[D].东北师范大学,教育,2003,硕士.
[46]刘小娟.邵东方言疑问句的调查研究[D].湖南师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[47]刘泽.巴塞尔新资本协议及其在大连市银行业风险管理的应用研究[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[48]宋金声.脉冲电流对高强度螺栓钢组织及性能的影响[D].吉林大学,材料加工工程,2014,硕士.
[49]齐鑫虹.104例左主干病变的临床分析[D].大连医科大学,心血管内科学,2012,硕士.
[50]丁慧萍.茶巴朗湿地外来鱼类的生物学及其对土著鱼类的胁迫[D].华中农业大学,渔业资源,2014,硕士.