大肠杆菌Ⅰ型群体感应功能研究

【摘要】病原性大肠杆菌是感染人类和动物的重要病原菌,严重危害畜牧养殖业并造成巨大的经济损失。大肠杆菌致病性与其自身毒力因子密切直接相关,而这些毒力因子必需共同作用于宿主机体,发挥毒力致病作用,造成机体损害。值得注意的是,毒力因子在体内受到严格调控,而群体感应系统则参与了这一重要调控过程。本试验研究探析了大肠杆菌群体感应I型系统的相关调控功能,为病原体和机体相互作用的准确机制深入研究和大肠杆菌感染的防控提供新颖的理论基础。在细菌生长过程中,能够释放特定信号分子；通过对这些信号分子的感知,细菌可以确定周边环境中的同类数量,并据此调节特定信号分子相关的多种毒力基因：这种现象被称作群体感应(QuorumSensing),而参与群体感应系统的特定信号分子被称为自体诱导子(Autoinducer,AI),主要包括AI-1和AI-2两类分子。在II型群体感应系统中,luxS和pfs两基因在AI-2合成中起着重要作用,是已知重要相关基因；而在I型群体感应系统中,由于大肠杆菌自身缺乏合成酰基高丝氨酸内酯(AHL)的合成酶luxI,而仅具有AI-1受体,即LuxR同源蛋白SdiAo大肠杆菌AHL受体SdiA蛋白为非水溶性包涵体,只有在感知外源AHL信号分子后,此时AHL受体SdiA蛋白才能被激活,有相当一部分转化为有效折叠的可溶性功能蛋白,并发挥调控作用。研究人员尝试用过表达SdiA受体蛋白、添加外源AHL信号分子、构建重组大肠杆菌合成内源性AHL的方法,对大肠杆菌I型群体感应系统及其介导的细菌相关生理现象进行了一定程度的前提研究,包括激活细胞分化基因簇ftsQAZ,提高对丝裂霉素C、喹诺酮类及其他种类抗生素的抗性；细菌运动性受到抑制；QS-II活力受到抑制；然而,由于一直无法从动物消化道内获取合成AHL并为大肠杆菌提供AI-I的菌株源,阻碍了病原性大肠杆菌I型群体感应系统功能的深入探讨,并引发肠道环境中是否存在激活大肠杆菌I型群体感应系统的外源AHL的质疑。事实上,之前研究人员通过多种手段进行筛选,均没有成功先例。在牛瘤胃中,虽然分泌合成这些特定AHL信号分子的特定细菌同样一直没有成功分离,然而多种QS-I型系统信号分子酰基高丝氨酸内酯(AHL)却在牛瘤胃中存在,成功分离,并对其功能进行检测；这些AHL信号分子被认为在牛消化道内参与调节食源性病原菌基因表达和调控,在病原菌通过胃肠消化道及消化道内生存定殖进程中发挥重要作用。其中,AHL信号对病原大肠杆菌0157：H7致病过程的调节尤为引起研究人员关注,显得尤为重要。鉴于上述研究积累和AHL阳性菌必然存在的理论推测,我们在牛瘤胃菌平台上进行研究,设计出一种改进的AHL阳性菌分离方案,在牛瘤胃和猪肠道内成功筛选出AHL阳性菌,并就AHL产生的特征、功能和病原大肠杆菌互作进行了深入探析。富集、蒸发和浓缩等重要步骤增加在改进的筛选流程中,由牛瘤胃液中成功分离了一株铜绿假单胞菌,命名为YZ1,并对其合成AHL的能力进行鉴定。基于JZA1报告菌中含有lacZ报告基因,在AHL存在环境中能够激活半乳糖苷酶活性的特性,其探测范围和对AI-1敏感度较高,我们选定该报告菌定量检测YZ1产AHL能力,发现在6h时合成能力达到最高峰；16srDNA法被运用于对YZ1菌的鉴定,确认其为铜绿假单胞菌；考虑到仅利用JZA1检测而可能产生的假阳性结果,利用CV026报告菌在感知到外源AHL的环境中激活紫色色素合成的特性,进一步确认其AHL合成能力；随后利用pSB401、pSB1142两株报告菌分别用于感知短链、长链AHL并对YZ1合成AHL的种类进行检验；利用液质联谱,在YZ1培养上清中鉴定出至少三种不同的AHL分子,包括C4-HSL、C8-HSL、3-oxo-C12-HSL。将铜绿假单胞菌YZ1株中短链和长链AHL的合成基因lasI及rhlI分别克隆入0157：H7大肠杆菌,成功赋予其自身合成AHL的能力,并进一步证明铜绿假单胞菌合成的AHL能调控大肠杆菌相应基因表达,激活SdiA受体蛋白表达上调约1.7倍；泳动实验和耐酸性实验表明,铜绿假单胞菌合成的AHL调控大肠杆菌的生理代谢,受调控重组大肠杆菌运动性下降25%,耐酸性提高约4倍,且上述表型变化与鞭毛FliC编码基因的4倍下调、gad耐酸性基因的2倍上调相符一致。综上研究结果表明,宿主体内特定群细菌通过I型群体感应系统参与对大肠杆菌相关基因和毒力的调控。这是首次成功由牛瘤胃中分离出AHL阳性菌,并对其AHL合成能力和特性进行鉴定,进而为肠道细菌通过群体感应系统与大肠杆菌体内互作提供了新颖证据,第一次实验验证了牛瘤胃大肠杆菌群体感应I型系统假说模型。鉴于研究人员一直未能成功在猪肠道内分离出AHL阳性菌,阻碍了对猪源大肠杆菌QS-I型系统功能的深入研究。为了继续挖掘群体感应I型系统对猪源大肠杆菌毒力的调控机制,基于成功改良的筛选方法和手段,由猪肠道内容物中首次分离出AHL阳性菌,命名为嗜水气假单胞菌YZ2,并对其合成AHL的能力进行鉴定。利用JZA1报告菌对AHL信号的高度敏感性定量检测YZ2产AHL能力；16srDNA法被运用于对YZ2的鉴定,确认其为嗜水气假单胞菌：同样考虑到仅利用JZA1检测可产生假阳性结果,同时利用CV026报告菌进一步确认其AHL合成能力；进而利用pSB401、pSB1142两株生物报告菌分别用于感知短链、长链AHL并对YZ2合成AHL的种类进行检验,发现其只能合成短链AHL；利用液质联谱,在YZ2培养上清中鉴定出C4-HSL优势AHL分子。将YZ2中luxI同源基因、AHL合成酶基因ahyl分别克隆入猪源F18ab大肠杆菌中,成功赋予大肠杆菌合成内源性AHL的能力,并进一步证明大肠杆菌能够运用嗜水气假单胞菌合成的外源AHL能够激活SdiA受体蛋白,上调其表达约1.8倍；同时通过泳动实验和耐酸性实验,证明其能够通过AHL调控大肠杆菌的生理代谢,受调控重组大肠杆菌运动性下降25%,耐酸性提高约3倍；此表型变化与鞭毛FliC编码基因的5倍下调、gad耐酸性基因的4倍上调相符-致；综上研究结果证明猪肠道内特定细菌群可以通过群体感应系统调控猪源大肠杆菌毒力,也为深入猪源大肠杆菌与肠道内细菌互作提供了新颖证据和研究平台。在确定牛瘤胃、猪肠道内存在AHL阳性菌,能够产生释放AHL调节大肠杆菌毒力,并且对牛源、猪源大肠杆菌均起到抑制鞭毛表达作用的基础上,为了进一步验证大肠杆菌毒力受QS-I系统的调控机制,本研究选择了猪源F18大肠杆菌作为研究对象,同时将小肠结肠炎耶尔森菌luxI同源基因yenI克隆入F18大肠杆菌107/86。表达基因yenI重组菌能够合成内源性高丝氨酸内酯AHL,并通过生物报告菌CV026介导cross-streaking试验检测加以验证。在合成内源AHL的重组菌中,利用泳动平板实验,发现鞭毛表达受到抑制,运动性减弱约33%；利用结晶紫法对生物被膜进行定量检测,发现生物被膜形成能力减弱约32%；利用生物报告菌BB170对生物发光现象进行检测,发现群体感应Ⅱ型系统活性同样受到抑制,在对数期下调30%。通过粘附实验检测细菌对猪小肠上皮细胞的黏附能力,重组菌中下降至野生株的25%；通过庆大霉素杀灭细胞周围未侵袭的大肠杆菌以进行侵袭实验,证明重组菌对IPEC-J2的侵袭能力同样受到削弱,降至野生株的30%,利用荧光定量PCR对鞭毛受抑制的现象加以确认。本研究为进一步确认A1-I在调控大肠杆菌毒力中的关键作用进行了探讨。在之前的研究中,我们发现大肠杆菌Ⅰ型、Ⅱ型群体感应系统同时参与了大肠杆菌鞭毛调控进程。为进一步阐明其调控机制,我们选择F18大肠杆菌107/86作为研究对象,构建了表达内源性AHL的重组菌与Ⅱ型luxS基因缺失株,从而建立起研究Ⅰ型群体感应系统和Ⅱ型系统的平台,并在此基础上检验其对鞭毛调控的影响。泳动实验、荧光定量、及免疫因子定量实验均被用于对鞭毛表达量的检测。鞭毛素本身的缺失同样能对群体感应Ⅱ型系统活性产生抑制作用,故而证明群体感应系统与鞭毛素表达之间存在着相互协同调控机制。
【作者】羊扬；
【导师】朱国强；
【作者基本信息】扬州大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】F18+大肠杆菌；大肠杆菌O157:H7；鞭毛；群体感应；铜绿假单胞菌；嗜水气假单胞菌；

【参考文献】
[1]孙娜.论我国检察机关参与行政公益诉讼制度构建[D].安徽大学,法律,2013,硕士.
[2]李浩.添加氧化铝对铝用碳素阳极性能影响的研究[D].东北大学,化学工程,2011,硕士.
[3]安怀杰.全抗体在CHO细胞的高效表达[D].中国人民解放军军事医学科学院,遗传学,2004,硕士.
[4]刘丹枫.清代武进士仕途研究[D].辽宁大学,中国古代史,2012,硕士.
[5]席梦雪.鹿角场—李子坝地区嘉陵江组二段沉积相及储层特征研究[D].成都理工大学,地质学,2013,硕士.
[6]徐蒙.新型智能灌浆、压水检测系统的开发与研究[D].中南大学,2010.
[7]朱晓华.微流控芯片的设计制备及用于内皮祖细胞生长行为的研究[D].西南交通大学,生物医学工程,2014,硕士.
[8]殷振环.PWM整流器直接功率控制的研究[D].北京交通大学,2009.
[9]陈旻.商业银行拓展小微企业信贷模式研究[D].湖南师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[10]刘馨泽.凌源市社会主义新农村建设存在的问题与对策研究[D].渤海大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2014,硕士.
[11]本刊讯.书讯[J].冶金自动化,2014,02:8.
[12]亢飞飞.听障学生随班就读社会适应能力发展的叙事研究[D].华中师范大学,特殊教育学,2013,硕士.
[13]徐粤.锂离子电池锡基复合负极与富锂层状正极材料的制备与电化学性能表征[D].浙江大学,材料工程,2014,硕士.
[14]沈斌.基于频谱感知的Femtocell网络中干扰抑制的研究[D].江苏科技大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[15]崔阳紫.出租车经营权性质分析与法律规范[D].南京师范大学,法律,2012,硕士.
[16]张方霞.基于ANSYS压电复合振子的模态分析[D].江西农业大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[17]范庆增,肖金法,曹书经.双密度显示的实现[J].石油地球物理勘探,1982,06:80-81.
[18]张昕昕.中美国高中数学课程标准比较[D].东北师范大学,学科教育,2012,硕士.
[19]李金玲,张琼,宫树梅,刘春玲.天津高校创业生态系统研究[J].管理观察,2013,19:85-87.
[20]崔启悦.杭州西溪国家湿地公园审美意象研究[D].中南林业科技大学,风景园林,2013,硕士.
[21]王美霞.具有共生作用乳酸菌与酵母菌培养基优化及促生物质的分离[D].内蒙古农业大学,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[22]张博.大学生道德冷漠现象的伦理分析[D].武汉纺织大学,思想政治教育,2014,硕士.
[23]王静静.高中思想政治课教学中主体间性师生关系的构建[D].苏州大学,学科教学,2012,硕士.
[24]颜林淋.番茄红素对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用[D].南华大学,内科学,2012,硕士.
[25]朱雅琴.乌海银行发展战略研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[26]孙佳明.跨文化交际中的“文化休克”现象研究[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[27]孙星,劳军,何化,程田田,王晓娟,黄方.功能化石墨烯量子点在选择性细胞荧光标记及靶向药物输送中的应用[A].中国化学会.中国化学会第三届全国生物物理化学会议暨国际华人生物物理化学发展论坛论文摘要集[C].中国化学会:,2014:1.
[28]翁立婷.国有商业银行员工培训效果影响因素评价及提升对策研究[D].北方工业大学,企业管理,2014,硕士.
[29]罗瑞婷.汉维粗俗语的对比[D].新疆师范大学,中国少数民族语言文学,2013,硕士.
[30]黄春雨.重庆地区村镇住宅建筑用能模型研究[D].重庆大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2014,硕士.
[31]彭振翼.固态存储系统PCIe接口的设计方法与实现[D].华中科技大学,计算机技术,2013,硕士.
[32]刘超群.我国财险公司偿付能力预警机制研究[D].浙江工商大学,金融学,2013,硕士.
[33]汪司飞.统计数据质量控制方法研究[D].苏州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[34]吕文辰.社会资本对知识员工职业成功影响研究[D].山东财经大学,企业管理,2012,硕士.
[35]刘婷.体育高校学生媒介素养现状及教育策略研究[D].首都体育学院,体育人文社会学,2013,硕士.
[36]何垚.高速铁路车网谐波特性研究[D].西南交通大学,电气工程,2013,硕士.
[37]杨健.D公司（中国）应急物流的成因与解决方案研究[D].复旦大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[38]周志翔.胃癌术后不同消化道重建对2型糖尿病疗效的对比研究[D].延安大学,外科学,2014,硕士.
[39]颜炳正.基于副枪的转炉控制系统的研究与实现[D].上海交通大学,软件工程,2013,硕士.
[40]朱靓.高灵敏的细胞因子化学发光免疫分析新方法研究[D].扬州大学,2013.
[41]李宗.我国药品不良反应监测体系的现状、问题与对策研究[D].厦门大学,公共管理,2014,硕士.
[42]陈元良.异种脱细胞肌腱鼻充填材料的生物相容性研究[D].南方医科大学,外科学,2012,硕士.
[43]王冲.目的论视角下的晋商文化旅游资料英译研究[D].西北大学,英语笔译（专业学位）,2014,硕士.
[44]本报记者张楠.更多用户将实现桌面3D打印[N].中国计算机报,2013-12-02026.
[45]王泽昕.稀土掺杂纳米Ni-Zn铁氧体的制备与性能研究[D].兰州理工大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[46]汤占岐１,２,　刘　焜１,　王　伟１,　刘小君１.转动与摆动复合运动下脂润滑关节轴承的数值分析[J].应用数学和力学,2015,02:.
[47]康平.高中文言文教学中传统教学方法运用的研究[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[48]张旭.特低扬程大型竖井贯流泵装置试验研究[D].扬州大学,水工结构工程,2011,硕士.
[49]唐春卉.中国文化“软实力”建设研究[D].大连海事大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[50]梁彦嫔.面向物联网的RFID关键技术及应用研究[D].天津理工大学,计算机技术,2013,硕士.