脑心肌炎病毒双抗原夹心ELISA建立、血清学调查、毒株分离及RNA干扰研究

脑心肌炎病毒双抗原夹心ELISA建立、血清学调查、毒株分离及RNA干扰研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-10-31 分类:参考文献 喜欢:3403
师大云端图书馆

【摘要】脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)可以感染多种哺乳动物、啮齿类动物、节肢动物和人并引发脑炎、心肌炎和心肌周围炎等症状;能引致母猪繁殖障碍和仔猪致死性心肌炎,致死率可达100%;而人多以亚临床形式存在。目前EMCV流行范围越来越广,在亚洲、非洲、美洲、欧洲和澳洲均有发现,且感染率逐年增加,不仅给养殖业造成严重的影响,同时也危害着人类健康。本研究以脑心肌炎病毒为对象,进行了以下实验研究:1.研发了EMCV双抗原夹心ELISA试剂盒并获得了国家发明专利授权:试剂盒以EMCV重组VP1、VP2和2C蛋白作为包被抗原,HRP标记的EMCV为酶标抗原,最适包被浓度为6μg/mL,最适酶标抗原浓度为1:400,最佳样品作用时间为45min,最佳显色时间为30min。与间接ELISA比较,符合率93.5%,特异性为95%,敏感性为92.9%,与FMD、HEV、PPV、BVDV等病毒抗血清无交叉反应,连续生产3批次,批间和批内CV%均小于6%。因此所研发的试剂盒重复性、特异性和稳定性较好,灵敏度较高,可以作为EMCV临床抗体检测和血清学调查有效的方法。2.EMCV血清病学调查:⑴从东北、华北、西北等7个地区采集健康人群血清,用双抗原夹心ELISA检测抗体,结果EMCV抗体平均阳性率为30.56%,东北地区最高,阳性率为43.23%,华中地区最低,阳性率为11.26%,各区域之间存在显著性差异;通过分析,抗体阳性率与性别之间不存在关联,与年龄存在可能的线性关系。⑵从上述7个地区专门采集20±5岁青年人群血清进行检测,结果显示抗体阳性率平均为46.00%,高于全年龄段样品平均值,可能与这个年龄段的非家庭性流动、群居性及饮食有直接关系。⑶从这7个地区采集猪血清进行检测,结果抗体平均阳性率为77.00%,明显高于人源EMCV抗体,各区域之间差异不显著。⑷从甘肃某猪场选取30头猪,从出生开始采集血清,之后15d、30d、60d、75d、90d、120d、150d时分别采集血清并检测,结果显示30日龄仔猪抗体阳性率最高为90%,60日龄下降到6.67%,之后抗体阳性率随着时间逐步升高,到150日龄抗体阳性率达到86.67%,经分析,0-60仔猪日龄存在母源抗体保护,60d之后失去母源抗体保护,可自然感染EMCV,群体抗体阳性率又逐步升高。3.首次分离到EMCV甘肃毒株,命名为GS01,对其全基因组进行测序,基因全长为7717bp,CDS区6879bp,Genbank登记号为:KJ524642,与国内其他分离毒株同源性99.4%-99.9%。病毒在BHK-21细胞培养3代后TCID50为10-5.8/0.1mL,病毒对小鼠具有极高致死性,LD50为10-3.75/0.5mL。4.针对EMCVVP1序列,设计合成了4对编码siRNA的序列并构建真核表达载体,脂质体介导转染至BHK-21细胞并接种EMCV,结果4组siRNA均能抑制脑心肌炎病毒增值,其中X109-2组抑制作用最显著,下降了103.5倍;各组均不能抑制FMDV、JEV等病毒,表明RNAi技术可以抑制EMCV病毒在BHK-21细胞中增殖,特异性好;X109-2组质粒转染至CHO-K1细胞中,还可以抑制pEGF-C1-EMCV-VP1的表达,表明RNAi具有明确靶向性。综上,本研究建立了双抗原夹心ELISA检测方法,积累了EMCV流行病学数据,首次分离到了EMCV甘肃毒株,探索了RNAi技术抑制病毒复制的效果,为进一步研究EMCV致病机制和防治等奠定基础。
【作者】冯若飞;
【导师】王永录;
【作者基本信息】中国农业科学院,预防兽医学,2014,博士
【关键词】脑心肌炎病毒;双抗原夹心ELISA;血清学调查;毒株分离;RNA干扰;

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