镉致大鼠神经细胞凋亡的线粒体途径及NAC的保护作用

【摘要】镉是一种高毒性的环境和工业污染物,急性或慢性镉暴露能引起多种器官和组织的损伤。镉可以引起血脑屏障功能障碍,进入脑组织引起神经元凋亡,临床研究表明镉是导致儿童学习障碍和神经退行性疾病发生的重要原因。微摩尔级的镉能引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活,导致线粒体的功能紊乱、线粒体膜电位下降、通透性发生变化、线粒体内物质释放进入胞浆。但是线粒体途径在镉诱导神经细胞凋亡过程中的作用机制仍存在疑问。本研究以体外培养大鼠大脑皮质神经元和PC12细胞为模型,通过体外试验探讨线粒体途径在镉诱导神经细胞凋亡中的作用机制,MAPK的激活在线粒体途径中的作用,以及乙酰半胱氨酸(NAC)在上述过程中的保护作用。1、镉诱导神经细胞凋亡为研究镉对神经细胞的凋亡作用,不同浓度(0、5、10、20μmol/L)醋酸镉处理原代细胞和PC12细胞12h或24h,MTT法测定细胞存活率,AnnexinV-FITC染色法测定细胞凋亡率。结果表明,随着镉剂量的增加,神经细胞的存活率逐渐下降,12h和24h各剂量染镉组细胞存活率均显著或极显著(P<0.05或P<0.01)低于对照组；随着镉剂量的增加,细胞皱缩,脱落,轴突、树突和神经网络消失,AnnexinV阳性细胞数量与对照组相比呈显著或极显著(P<0.05或P<0.01)增加。说明镉诱导原代细胞和PC12细胞凋亡存在剂量-效应关系。2、镉诱导神经细胞凋亡的线粒体途径为研究线粒体途径在镉诱导神经细胞凋亡中的作用,本试验以原代细胞和PC12细胞为模型,0-20μmol/L醋酸镉处理细胞24h。免疫印迹法检测线粒体途径相关蛋白CytC的释放,Caspase-3和PARP活化,Bax和Bcl-2表达量,Z-VAD-frnk对Caspase依赖性途径的影响；并运用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG核转位。结果表明,与对照组相比,随着镉浓度的增大,CytC的释放,Caspase-3和ARP活化显著或极显著(P<0.05或P<0.01)升高。添加100μmol/L的Z-VAD-frnk能抑制镉引起的原代细胞Caspase-9、Caspase-3和PARP的活化,细胞存活率的下降,细胞核形态的变化。与对照相比,10μmol/L醋酸镉处理PC12细胞能引起AIF和EndoG核转位。这表明镉能通过线粒体途径诱导神经细胞凋亡(包括Caspase依赖性和非Caspase依赖性途径)。3、镉诱导神经细胞凋亡的MAPK途径为研究MAPK激活在镉诱导神经细胞凋亡中的作用,本试验以原代细胞和PC12细胞为模型,0-20醋酸镉处理细胞不同时间,免疫印迹法或免疫组化染色法检测MAPK成员ERK.JNK和p38MAPK活化；MAPK特异性磷酸化抑制剂与镉联合作用原代细胞和PC12细胞,检测抑制剂对ERK、JNK和p38MAPK磷酸化活化的抑制作用,以及抑制MAPK磷酸化对细胞存活率、凋亡率的影响。结果表明,10μmol/L镉作用PC12细胞1h后,ERK磷酸化水平开始升高,一直到12h都高于对照组；JNK和p38MAPK的磷酸化水平于镉作用4h后开始升高,一直维持到12h,呈时间-效应关系。5、10、20μmol/L镉处理原代细胞和PC12细胞后ERK、JNK、p38MAPK磷酸化水平均呈显著或极显著(P<0.05或P<0.01)上升,呈现剂量-效应关系。ERK的磷酸化抑制剂U0126(10μmol/L)、JNK的磷酸化抑制剂SP600125(20μmol/L)和p38MAPK的磷酸化抑制剂ISB202190(20μmol/L)与镉联合作用能分别降低镉引起的ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平的升高。U0126和SP600125能显著或极显著(P<0.05或P<0.01)抑制镉引起的原代细胞和PC12细胞存活率下降和凋亡率升高。表明ERK和JNK参与调控镉引起的原代细胞和PC12细胞凋亡。4、ERK、JNK调节镉诱导神经细胞凋亡的线粒体途径为研究ERK、JNK的激活在镉诱导神经细胞凋亡的线粒体途径中的作用,本试验以原代细胞和PC12细胞为模型,ERK抑制剂U0126(10μmol/L)和JNK抑制剂SP600125(20μmol/L)与镉联合作用原代细胞和PC12细胞。免疫印迹法检测线粒体途径相关蛋白CytC的释放,Caspase-3和PARP活化,Bax和Bcl-2表达量；免疫荧光染色检测AIF和EndoG核转位。结果表明,与10μmol/L镉处理组相比,抑制ERK、JNK的磷酸化能显著或极显著(P<0.05或P<0.01)抑制镉引起的CytC的释放、Caspase-3和PARP的激活、Bcl-2/Bax比值的下降；AIF和EndoG的核转位。表明ERK、JNK的激活参与调控镉通过线粒体途径诱导的神经细胞凋亡(包括Caspase依赖性和非Caspase依赖性途径)。5、NAC在镉诱导神经细胞凋亡中的保护作用为研究NAC在镉诱导神经细胞凋亡中的保护作用,本研究用10醋酸镉和NAC(100单独或联合作用PC12细胞24h。MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测30D、GSH-Px、CAT活力和MDA含量,免疫印迹检测CytC的释放,Caspase-3和PARP活化,Bax和Bcl-2表达量,免疫荧光染色检测AIF和EndoG核转位。结果表明,NAC能显著或极显著(P<0.05或P<0.01)抑制镉引起的PC12细胞存活率下降和凋亡率上升；CAT活力上升,GSH-Px活力下降,MDA含量上升；CytC的释放、Caspase-3和PARP的激活、Bcl-2/Bax比值的下降；AIF和EndoG的核转位。表明NAC能抑制镉通过线粒体途径诱导的原代细胞和PC12细胞凋亡。
【作者】江辰阳；
【导师】刘宗平；
【作者基本信息】扬州大学，临床兽医学，2014，博士
【关键词】镉；大鼠神经元细胞；凋亡；线粒体途径；MAPK途径；N-乙酰-L-半胱氨酸；

【参考文献】
[1]高瑞.六方氮化硼材料的制备及性能研究[D].山东大学,2010.
[2]牛春洋.特种车辆红外辐射特性仿真及发射率测量[D].哈尔滨工业大学,工程热物理,2013,硕士.
[3]郭青松,刘桂琴,吴喜福.台车式燃气热处理炉气动双位蝶阀故障分析及其改进[J].一重技术.2001(Z1)
[4]史志刚.六盘山地区断裂新活动特征与大震危险性趋势判定[D].中国地震局兰州地震研究所,构造地质学,2011,硕士.
[5]许凌云.多媒体扩频传输中关键技术研究[D].南京航空航天大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[6]ATHITAYAKHAMPHIOMA（马晓晨）.泰国香米出口中国物流风险管理研究[D].北京交通大学,2015.
[7]艾嘉琪.护士接种流感疫苗的知识、态度和行为的调查性研究[D].第二军医大学,护理学,2013,硕士.
[8]刘玉文.颈椎生理弧度的恢复对CSM术后症状改善的影响[D].南京医科大学,临床医学,2013,硕士.
[9]陈艳.鱼肉肌原纤维凝胶的modori产生机理研究[D].浙江工业大学,2004.
[10]周邦瑞.研究式教学模式的构建[D].江西师范大学,教育,2003,硕士.
[11]苏京.基于绩效提升视角的企业内部冲突管理研究[D].兰州理工大学,企业管理,2012,硕士.
[12]杨旗.转炉提钒静态模型研究[D].重庆大学,2002.
[13]常振华.水利工程项目施工材料质量控制研究[D].中国地质大学（北京）,项目管理,2014,硕士.
[14]钱大艳.淀粉基多孔及膜材料的制备和性能研究[D].天津大学,2013.
[15]徐伟.生态产业链动态均衡的VI模型及应用研究[D].天津理工大学,应用数学,2013,硕士.
[16]田呼.内蒙古农牧民收入现状及增收对策研究[D].内蒙古师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[17]贾云梅.从“投标书”翻译实践谈法律翻译难点及对策[D].河北师范大学,翻译,2013,硕士.
[18]吴相石,张松岩.应用数据仓库技术加快企业信息化改造[J].锅炉制造,2003,03:51-59.
[19]范博园.医院合理使用抗菌药物的指标体系研究[D].苏州大学,社会医学与卫生事业管理,2012,硕士.
[20]齐婷婷.供应链视角下DT公司研发物料采购控制策略[D].北京交通大学,2014.
[21]朱媛媛.过渡型社区治理体制研究[D].苏州大学,行政管理,2013,硕士.
[22]孙金龙.基于Volterra级数的射频功率放大器记忆效应表征与建模研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[23]王一玲.我国进口食品安全监管问题研究[D].华中师范大学,公共管理,2014,硕士.
[24]丁德云.基于精益六西格玛的WY公司生产管理优化[D].广东工业大学,工商管理,2013,硕士.
[25]谷献模.功能化碳纳米管及其复合材料的制备与催化性能研究[D].哈尔滨工业大学,2014.
[26]柴丹.甘蓝细胞质雄性不育类型鉴定及比较研究[D].西南大学,蔬菜学,2014,硕士.
[27]齐梦迭.AKt-YAP信号通路在谷氨酰胺饥饿诱导Hela细胞凋亡过程中的作用研究[D].苏州大学,麻醉学,2014,硕士.
[28]赵显富.通用型中文投入产出表的设计[J].冶金自动化,1988,06:15-18.
[29]张文杰.微博网络的传播模型和观点演化趋势研究[D].北京交通大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[30]夏任司.四足机器人步态与路径规划[D].华中科技大学,机械电子工程,2013,硕士.
[31]李维珍.公安县土地利用变化及土地生态安全动态研究[D].华中师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[32]王元凯.幼儿园戏剧艺术教育研究[D].山东师范大学,学前教育学,2013,硕士.
[33]崔宝乾.胶质瘤干细胞诱导巨噬细胞癌变的实验研究[D].苏州大学,神经外科学,2013,硕士.
[34]张晓东.法治视域下的中国司法改革[D].吉林大学,公共管理,2014,硕士.
[35]黄晓燕.桡骨远端肿瘤切除后腓骨近端重建的相关解剖学及临床应用研究[D].苏州大学,骨外科,2014,硕士.
[36]张仙鹏.磁性金属纳米颗粒的自组装生长与磁学性能研究[D].山西师范大学,原子与分子物理,2013,硕士.
[37]李金元.二战后美国小学阶段课程设置演变及其特点研究[D].沈阳师范大学,教育史,2014,硕士.
[38]王小蒙.预循环变形对不同取向铜单晶体单向力学性能的影响[D].东北大学,材料物理与化学,2011,硕士.
[39]张敏.基于宽带光源的可调微波光子滤波器研究[D].西南交通大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[40]郑羽良.渗流井取水物理模拟试验研究[D].长安大学,地下水科学与工程,2013,硕士.
[41]杨钊.基于Android的视频采集系统的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[42]郭思聪.莫来石—氧化锆复相陶瓷制备工艺及应用研究[D].沈阳工业大学,材料学,2013,硕士.
[43]崔飞飞.两类时标动力方程解的存在性及振动性[D].河北师范大学,应用数学,2013,硕士.
[44]朱正意.基于层层自组装技术石墨烯复合材料的制备及性能研究[D].江南大学,2014.
[45].浙江工业大学之江学院[J].中国成人教育,2014,04:2.
[46]周芳.政府背景、两权分离度与民营企业绩效关系研究[D].浙江理工大学,企业管理,2012,硕士.
[47]马彦彦,李国发,张星宇,田纳新,祝文亮,翟桐立.叠前深度偏移速度建模方法分析[J].石油地球物理勘探,2014,04:687-693+3.
[48]周辉.基于SOA集成环境下整车企业产品协同开发模式研究[D].重庆大学,工业工程,2014,硕士.
[49]王征.通化市基本建设财政管理研究[D].吉林大学,会计,2012,硕士.
[50]李彦斌.广州长和公司节电产品营销策略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.