自噬在镉致大鼠神经细胞毒性中的作用及调控机制

自噬在镉致大鼠神经细胞毒性中的作用及调控机制

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-11 分类:开题报告 喜欢:4515
师大云端图书馆

【摘要】自噬(即自体吞噬),是一种在生理上和进化上高度保守的现象,主要依赖溶酶体降解长寿命蛋白和细胞器等物质。研究表明,环境应激可诱导细胞发生自噬,自噬过程有助于维持细胞的动态平衡,但过量持续的自噬会破坏细胞器和重要的蛋白质导致细胞死亡,这种死亡方式是caspase依赖的程序性死亡。镉是一种具有很强毒性的重金属,低浓度的镉就具有神经毒性,能严重影响神经系统的功能如神经行为学缺陷,认知障碍,活动过度等。体外研究表明镉可激活一系列级联反应,导致神经细胞发生凋亡和坏死,但关于自噬在其中的作用,尚未见有相关文献报道。本研究以PC-12细胞系和大鼠大脑皮质神经元(原代神经细胞)作为研究模型,通过体外试验探讨了自噬在镉致两种细胞毒性损伤中的作用及相关调控机制,为进一步阐明镉的神经毒性作用提供了理论依据。1.镉对神经细胞活性的影响为了研究PC-12细胞培养及镉对神经细胞活性的影响。对PC-12细胞培养方法进行改进,采用MTT法测定了不同浓度镉(0、2.5、5、10、20μmol/L)染毒24h20μmol/L镉处理0、1、2、4、6、8、12、24h后对PC-12和原代神经细胞活性的影响。结果表明,PC-12细胞单个或两三个一起分布,形状为近似圆形,周边发出晕光,微贴壁。接种24h时细胞开始聚团,72h聚团现象更明显,生长曲线显示细胞在43h时处于对数生长期,与ATCC中的倍增时间基本一致,可以用于下一步研究;随着镉处理浓度的增加和时间的延长,PC-12和原代神经细胞的活性明显降低,在一定的浓度和时间范围内,呈现明显的剂量依赖和时间依赖效应,说明镉对神经细胞具有明显的毒性作用。2.镉诱导神经细胞自噬的研究为了研究镉是否能诱导PC-12和原代神经细胞发生自噬,采用0、2.5、5、10、20μmol/L镉作用4h,20μmol/L镉作用0、2、4、6、8、12、24h,免疫印迹法检测自噬特异性蛋白LC3的表达;20μmol/L镉作用4h,免疫荧光检测聚点率,吖啶橙染色观察酸性自噬泡,MDC染色观察晚期自噬溶酶体结构的变化;20μmol/L镉作用4h和24h,透射电镜观察染毒细胞内细胞器的变化。免疫印迹结果表明,随着镉浓度的增加,LC3-Ⅱ蛋白表达量显著上升,呈现一定的剂量-效应关系。随着染毒时间的延长,LC3-Ⅱ的表达逐渐增加,在4h时达到最高(p<0.01),随后逐渐降低,呈一定的时间-效应关系;免疫荧光检测表明,对照组的细胞LC3呈弥散分布,20μmol/LCd处理后,LC3呈点状在细胞核周边聚集。计数阳性细胞,处理组与对照组差异极显著(p<0.01);吖啶橙染色表明,正常细胞显示了较少的红色荧光,经镉处理后的细胞内红色荧光强度明显增加:MDC染色揭示,对照组MDC荧光较弱,20μmol/L镉处理4h,MDC荧光信号逐渐增强,并有荧光积聚斑点;透射电镜结果表明,20μmol/L镉处理4h,两种细胞出现了典型的自噬体,处理24h,染色质开始在核周边积聚,胞质空泡化。提示镉可以诱导两种细胞发生自噬和凋亡。3.自噬在镉致神经细胞损伤中的作用为了揭示自噬在镉致神经细胞毒性损伤中的作用,本研究利用镉单独或联合自噬的特异性抑制剂羟氯喹(CQ)作用4h,或联合诱导剂雷帕霉素(RAP)作用24h,对PC-12细胞和原代神经细胞LC3表达的影响,MTT法测定了CQ和RAP对两种细胞活性的影响。结果表明,联合应用CQ,与4h镉处理组比较,两种细胞LC3-Ⅱ的蛋白表达量显著上升(p<0.05),但细胞活力都有明显下降(p<0.05或p<0.01);联合应用RAP作用24h,与24h镉处理组比较,两种细胞LC3-Ⅱ的蛋白表达量显著上调(p<0.05或p<0.01),同时细胞活力显著上升(p<0.05或p<0.01)。表明自噬在镉引起的细胞损伤中起保护作用。4.镉诱导神经细胞自噬和凋亡的关系为了探讨镉诱导神经细胞自噬与凋亡的相互关系,本研究利用镉单独或联合CQ作用4h,或联合RAP或caspase抑制剂Z-VAD-fmk作用24h,流式细胞术检测PC-12细胞凋亡率的变化,DAPI荧光染色观察原代神经细胞细胞核的变化。结果表明:与对照组比较,镉作用24h,PC-12细胞凋亡率从4.5%增加到45.8%,差异性极显著(p<0.01),镉联合caspase抑制剂Z-VAD-fmk作用24h,细胞凋亡率明显降低,与镉24h比较,差异性极显著(p<0.01),进一步说明镉可以诱导PC-12细胞发生凋亡。与镉4h组比较,镉联合CQ作用4h,细胞凋亡率11.1%增加到33.7%,差异性极显著(p<0.01):与镉24h组对比,镉联合RAP作用24h,凋亡率从45.8%降至14.7%,差异性极显著(p<0.01)。与正常原代神经细胞比较,20μmol/L镉处理24h组出现染色质固缩、核碎裂;镉联合CQ作用4h,损伤的细胞增多,出现新月状、浓缩的胞核,甚至出现核碎裂;而镉联合RAP或Z-VAD-fmk组,细胞的损伤明显减轻。说明镉诱导的自噬可以延迟凋亡的发生。5.classⅢPI3K/Beclin-1/Bcl-2通路在镉诱导神经细胞自噬中的作用为研究classⅢPI3K/Beclin-1/Bcl-2通路在自噬中的作用,20μmol/L镉分别作用PC-12和原代神经细胞0、2、4、6、8、12、24h,免疫印迹法检测相关蛋白的表达,加入PI3K抑制剂LY2940026h后,观察相关蛋白的表达和LC3聚点率的变化。20μmol/L镉处理两种细胞不同时间后,Beclin-1和classⅢPI3K的表达呈现先升高后降低的趋势,但classⅢPI3K的上调早于Beclin-1;Bcl-2在镉处理的早期出现短暂的升高,随后开始逐渐下降。LY294002不但显著抑制了Beclin-1,classⅢPI3K,和Bcl-2蛋白的表达,同时还能明显抑制LC3-Ⅱ的表达水平(p<0.05或p<0.01)及LC3聚点。说明classⅢPI3K/Beclin-1/Bcl-2通路在镉诱导的自噬中起正调控作用,可能参与了自噬体膜的延伸过程。6.ERK信号通路在镉诱导神经细胞自噬中的作用为研究ERK信号通路在自噬中的作用,PC-12细胞用20μmol/L醋酸镉处理不同时间(0、0.5、1、2.4h),PC-12细胞和原代神经细胞分别用20μmol/L镉联合ERK抑制剂U0126作用4h,检测ERK、LC3和酸性自噬泡的变化。结果显示,镉作用于PC-12细胞0.5h,ERK1/2的磷酸化水平开始升高,一直维持到4h;U0126能明显抑制PC-12细胞和原代神经细胞ERK1/2的磷酸化水平,同时还能显著抑制LC3-Ⅱ的表达(p<0.05)和酸性自噬泡的形成。表明ERK是自噬的上游信号分子,它的激活有利于诱导自噬。7.氧化应激在镉诱导神经细胞自噬中的作用为了探讨镉引起的氧化应激与自噬的关系。本研究分别利用CQ和/或抗氧化剂NAC单独或联合镉,荧光染色和免疫印迹法检测晚期自噬溶酶体和LC3的变化来分析对自噬水平的影响;流式细胞术检测ROS、线粒体膜电位以及DNA片段化;LDH试剂盒检测LDH漏出率的变化。结果表明,镉联合CQ作用4h后,MDC荧光极显著增强,并且呈点状聚集在核周围。与镉4h处理组相比,NAC可以特异性的抑制LC3-Ⅱ的表达,差异性极显著(p<0.01)。与对照组相比,镉作用细胞24h和镉联合CQ处理4h后,ROS水平极显著增加(p<0.01),线粒体膜电位极显著下降(p<0.01),DNA片段化极显著增加(p<0.01),LDH漏出率极显著增加(p<0.01);与镉联合CQ组比较,NAC能显著降低神经细胞的ROS水平(p<0.05),但使细胞DNA片段化增多(p<0.05)。说明ROS和线粒体膜电位的变化在自噬的调节中发挥着重要作用,在镉暴露早期,ROS的产生有助于神经细胞诱导保护性自噬。
【作者】王棋文;
【导师】刘宗平;
【作者基本信息】扬州大学,临床兽医学,2014,博士
【关键词】醋酸镉;PC-12细胞;大鼠大脑皮质神经元;自噬;LC3;细胞保护;凋亡;Beclin-1;classⅢPI3K;Bcl-2;ERK;ROS;

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