羊草中6-MBOA对布氏田鼠繁殖激素和相关基因表达的影响

【摘要】许多特种经济动物是季节性繁殖动物,如何人为改变这些动物的繁殖规律,使其数量和质量满足人类的需求,向来是特种经济动物产业的主要目标。而寻找和利用合适的既能促进特种经济动物的发育和繁殖,同时又不带来食品安全问题的饲料添加剂,从而促进特种经济动物养殖业的发展,是特种经济动物养殖亟待解决的问题。很多特种经济动物为植食性动物,从它们所取食的植物中寻找天然的可促进动物繁殖的植物次生代谢物,并将后者作为饲料添加剂,是推动特种经济动物产业的发展的有效方法。6-MBOA是一些禾本科植物衍生的植物次生代谢物,国外已有研究证实其能促进许多动物的发育和繁殖。本研究首先以人工种植的内蒙古草原优势牧草羊草为研究对象,采用高效液相分析法(HPLC)测定不同生长期及不同处理条件下羊草中6-MBOA的含量变化,确定6-MBOA含量在羊草中的时序性变化规律,探讨引起6-MBOA含量变化的原因。其次,本研究以室内繁殖的小哺乳动物布氏田鼠为研究对象,运用Elisa、RT-PCR、蛋白印迹和组织学观察等方法测定血清中生殖激素水平、生殖器官形态差异、下丘脑相关繁殖基因和性腺中性激素合成酶相关基因表达量的变化,研究短期和长期腹腔注射6-MBOA对长光照条件下布氏田鼠繁殖的影响以及对青春期布氏田鼠性成熟的作用,探讨6-MBOA对动物繁殖的调控机制,为将该次生化合物开发为特种经济动物养殖饲料添加剂提供理论依据。研究结果如下：(1)羊草中6-MBOA的含量从羊草发芽后第7天到第17天逐渐降低,第7天和第8天的含量都显著大于第12天和第17天的含量(P<0.001)；用剪损伤、动物啃食和在剪损伤处涂抹布氏田鼠唾液处理羊草,处理1小时后,对照组和剪损伤组中6-MBOA含量都显著小于啃食组和涂唾液组(P<0.05),但在剪损伤组和对照组间没有显著差异(P>0.05)；处理后1天和5天后,对照组6-MBOA含量都显著小于其它3组(P<0.001)；处理10天后,对照组6-MBOA含量显著小于剪损伤组和涂处理组(P<0.001),而对照组与啃食组间没有显著差异(P>0.05)。重复测量分析表明,6-MBOA含量在对照组显著小于其它三个处理组(P<0.001),在剪损伤组显著小于涂唾液组和啃食组(P<0.001,P=0.003),在涂唾液组显著大于啃食组(P=0.016)。以上研究表明,整株羊草苗中6-MBOA含量有随着日龄的增长而下降的规律,据此推测内蒙古草原羊草在早春萌芽期具有较高的6-MBOA,随后会显著下降。羊草能对动物取食和机械损伤启动动态防御,6-MBOA类物质是其防御的主要物质；但机械损伤对羊草中6-MBOA的诱导反应滞后于布氏田鼠取食诱导反应,动物的唾液在诱导防御过程中可能起了重要的诱导作用。(2)雌性布氏田鼠短期腹腔注射6-MBOA后,血清中E2含量在低剂量组显著大于对照组(P=0.026);FSH和MEL含量都在中剂量组显著大于对照组(P=0.008,P=0.050)。下丘脑AVPV区和ARC区KiSSl基因的mRNA都在低剂量组显著大于对照组(P<0.001)；GPR54基因的：mRNA在对低剂量组显著大于照组(P=0.004)。卵巢中StAR基因的mRNA在低剂量组显著大于对照组(P=0.010);CYP19基因的mRNA在中剂量组和低剂量组显著大于对照组(P＜0.001,P=0.017),CYP11A1基因的mRNA在高剂量组显著大于对照组(P=0.002)。卵巢中StAR蛋白和CYP11A1蛋白含量都在低剂量组显著大于对照组(P=0.021)。成年雄性布氏田鼠短期腹腔注射6-MBOA后,睾酮含量在低剂量组和中剂量组显著大于对照组(P=0.012,P=0.004);FSH在低剂量组显著大于对照组(P=0.004);MEL在高剂量组显著小于对照组(P=0.002);LH水平在各组间无显著差异。下丘脑AVPV区KiSS1基因的mRNA在低剂量组显著大于对照组(P＜0.001);ARC区KiSS1基因的mRNA在中剂量组显著大于对照组(P=0.002);GPR54基因的mRNA在低剂量组和中剂量组显著大于对照组(P=0.028,P=0.012)。睾丸中StAR基因的mRNA和蛋白含量在低剂量组显著大于对照组(P=0.010,P=0.021);CYP11A1基因的mRNA在中剂量组显著大于对照组(P=0.022),CYP11A1蛋白含量在低剂量组显著大于对照组(P=0.021);CYP19基因的mRNA在高剂量组显著小于对照组(P=0.020)。6-MBOA对雌、雄布氏田鼠的短期影响实验结果表明,一定剂量的6-MBOA能显著上调下丘脑KiSS1基因的转录,促进FSH的分泌和性腺中StAR基因及CYP11A1基因的转录和表达。而对于CYP19基因而言,6-MBOA对雌性动物有促进作用,而对于雄性动物则呈现一定的抑制效应,因此一定剂量6-MBOA的短期作用可提高性激素合成与分泌,促进布氏田鼠的繁殖。(3)成年雌性布氏田鼠长期腹腔注射6-MBOA后,卵巢系数在高剂量组显著小于对照组(P=0.003)。FSH在中剂量组显著小于对照组(P=0.026)。AVPV区KiSS1基因的mRNA在低剂量组显著大于对照组(P=0.004);ARC区的KiSS1基因的mRNA在各组间没有显著差异；下丘脑GPR54基因的mRNA在低剂量组和高剂量组显著大于对照组(P=0.038,P=0.011)。卵巢StAR基因的mRNA在高剂量组显著小于对照组(P=0.027)；CYP11A1基因的mRNA和蛋白含量都在低剂量组显著大于对照组(P=0.034,P=0.045)；CYP19基因的mRNA和蛋白含量都在在高剂量组显著小于对照组(P=0.011,P=0.031)。成年雄性布氏田鼠长期腹腔注射6-MBOA后,睾丸系数在对照组显著大于中剂量组和高剂量组(P=0.001,P=0.010)。FSH和睾酮水平都在高剂量组显著小于对照组(P=0.006,P=0.037)。下丘脑AVPV区和ARC区KiSS1基因的mRNA在高剂量组显著小于对照组(P=0.037,P=0.002),同时下丘脑ARC区KiSS1基因的nRNA在对照组显著大于低剂量和中剂量组(P=0.035,P=0.045)；下丘脑GPR54基因的mRNA在高剂量组显著小于对照组(P=0.005)。GnRH、StAR、CYP11A1和CYP19基因的mRNA,StAR和CYP11A1蛋白含都在对照组显著大于低剂量、中剂量和高剂量组(P<0.040)。CYP19蛋白含量对照组显著大于低剂量组和高剂量组(P=0.002,P=0.005)。生精上皮厚度在对照组显著大于中剂量组和高剂量组(P=0.023,P<0.001)长期腹腔注射6-MBOA对成年雌、雄布氏田鼠影响的实验表明,长期施加6-MBOA抑制了下丘脑的KiSS1/GPR54系统,且对雄性布氏田鼠的抑制作用更强；6-MBOA也抑制了睾酮合成通路上的StAR和CYP11A1基因的转录以及卵巢中雌二醇合成过程中的StAR和CYP19基因的转录,对雄性布氏田鼠睾丸和雌性布氏田鼠卵巢的生长也有抑制作用,因此,长期施加6-MBO对布氏田鼠的生殖存在一定的抑制效应,且均存在剂量效应。(4)对21日龄雌性青春期布氏田鼠连续注射6-MBOA30天后,雌性布氏田鼠阴门开放时间在对照组显著大于低剂量组和中剂量组(P=0.049,P=0.002)。LH在对照组显著小于中剂量组(P=0.046)；E2在低剂量组显著大于对照组(P=0.008)。KiSS1基因、GPR54基因和GnRH基因的转录都在处理组与对照组间没有显著差异。StAR的转录在低剂量组显著大于对照组(P=0.011);CYP11A1的转录在低剂量组显著大于对照组(P=0.032)。StAR蛋白含量在对照组显著小于低剂量组和中剂量组(P=0.016,P=0.021)。对21日龄雄性青春期布氏田鼠连续注射6-MBOA30天后,其睾丸下降率在对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组分别为12.5%,12.5%,37.5%,25%。血清中LH在对照组显著小于低剂量组和中剂量组(P=0.031,P=0.005);FSH在对照组显著小于低剂量组和中剂量组(P=0.035,P=0.044)；睾酮在低剂量组显著大于对照组(P=0.003)。下丘脑AVPV区KiSS1基因的mRNA在对照组显著大于中剂量和高剂量组(P=0.029,P=0.043)；睾丸中StAR的mRNA和蛋白含量均在低剂量组显著大于对照组(P<0.001,P=0.016)；CYP11A1基因的mRNA在低剂量组显著大于对照组(P=0.036),CYP11A1蛋白含量在中剂量组显著大于对照组(P=0.048);CYP19基因的mRNA在对照组显著大于低剂量组、中剂量组和高剂量组(P=0.014,P=0.010,P=0.002),CYP19蛋白含量在对照组显著大于中剂量组和高剂量组(P=0.023,P=0.014)。睾丸中曲细精管直径和生精上皮厚度均在低剂量组显著小于其它三组(P≤0.001)。6-MBOA对雌、雄青春期布氏田鼠影响的实验表明,一定剂量的6-MBOA促进了睾丸的下降,使雌性阴门开放时间提前、性激素合成酶StAR和CYP11A1的转录和翻译水平提高,但对下丘脑kissl基因的转录无显著作用,对生殖器官的生长也无明显影响,因此,6-MBOA对长光照条件下青春期布氏田鼠的性成熟无显著的促进作用。(5)综上所述,6-MBOA类物质是羊草的防御物质,其参与了羊草的动态防御和诱导反应,布氏田鼠的唾液在诱导防御反应中有重要作用,支持植物对哺乳动物的动态防御反应普遍存在的假说。一定剂量6-MBOA的短期作用能提高性激素合成与分泌,促进布氏田鼠的繁殖；长期施加6-MBO对布氏田鼠的生殖存在一定的抑制效应；6-MBOA对长光照条件下青春期布氏田鼠的性成熟无显著的促进作用。6-MBOA对布氏田鼠繁殖的影响存在剂量效应,支持MBOA具有褪黑素的拮抗剂功能的假说,作为褪黑素的拮抗剂,它影响布氏田鼠的下丘脑-垂体轴,从而调控布氏田鼠的生殖。6-MBOA也可能直接作用于性腺。
【作者】戴鑫；
【导师】魏万红；
【作者基本信息】扬州大学，特种经济动物饲养，2014，博士
【关键词】布氏田鼠；羊草；6-MBOA；KiSS1基因；性激素合成酶；性成熟；

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