体外震波在缺血缺氧诱导的H9c2细胞凋亡中的作用研究

【摘要】目的：大量研究显示细胞凋亡在冠心病的病理生理过程中起着重要的作用。有证据表明,心肌缺血、缺氧、缺血再灌注损伤、氧化应激等因素均可引起心肌及内皮细胞凋亡。多种因素例如氧化应激、缺氧、缺乏生长因子、化学及物理毒性损伤等可通过线粒体及内质网途径的激活而启动细胞凋亡。多项研究报道抑制细胞凋亡可以阻断心衰的发展并改善心功能。体外心脏震波(CardiacShockWaveTherapy,CSWT)是目前国际上新近发展起来的前沿科技,可通过上调血管内皮生长因子(VEGF)增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性等途径使缺血区域的毛细血管生成增加,改善该区域心肌灌注。CSWT是否能够减轻缺血缺氧诱导的细胞凋亡目前少有报道,根据国内外目前的研究现状,我们将通过大鼠心肌细胞系H9c2缺血缺氧模型,检测SW对心肌细胞凋亡的影响,并进一步探讨其可能的机制,为缺血性心脏病的治疗提供新的思路。方法：选用大鼠心肌细胞来源的细胞系H9c2为研究对象,建立缺血缺氧损伤模型,行不同剂量震波(SW)治疗,观察其对调亡的影响。1、将H9c2细胞换用无血清培养基,放入含有5%氧气-90%N2-5%C02的三气培养箱中培养,分别缺氧培养12、24、36、48h,MTT方法检测不同时间缺血缺氧对H9c2细胞活力的影响。2、根据预实验的结果,H9c2细胞缺血缺氧处理24h,建立细胞凋亡模型。分别用Hoechst染色方法及AnnexinV-FITC检测方法检测H9c2细胞凋亡情况,应用流式细胞仪检测H9c2细胞内活性氧产生情况,并检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase-3的表达情况。3、H9c2细胞缺血缺氧处理24h后,分别用0.06、0.09、0.12mJ/mm2能量的SW处理细胞,运用MTT方法检测不同能量的SW对H9c2细胞活力的影响。Hoechst染色方法及AnnexinV-FITC检测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活性氧产生情况。WesternBlot方法检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase-3及Akt、ERK、p38MAPK信号通路的表达情况。结果：1、与对照组相比,缺血缺氧可降低H9c2细胞的细胞活力,并呈现时间依赖性。当缺血缺氧作用时间为24h,细胞活力下降约26%,这是一个中等程度的损伤,不会影响后续的实验结果,因此我们选用缺血缺氧24h作为后续实验处理条件。2、将H9c2细胞缺血缺氧处理24h后,可以观察到缺血缺氧可诱导H9c2细胞发生凋亡,并且随着时间的延长细胞内活性氧的产生不断增多,Bax、Cleaved-Caspase-3的表达升高而Bcl-2表达下降,证明选择缺血缺氧24h作为处理条件是合适的。3、为探讨SW对缺血缺氧诱导的H9c2细胞凋亡的作用,分别采用0.06、0.09、0.12mJ/mm2能量的SW处理细胞,实验分为四组,包括正常对照组(NC组)、正常对照+震波组(NC+SW组)、单纯缺血／缺氧组(I/H组)、缺血缺氧+震波组(I/H+SW组)。结果表明,与单纯缺血／缺氧组进行比较,0.06、0.09、0.12mJ/mm2能量SW处理的细胞活力均有明显提高,并有显著的统计学差异,应用0.12mJ/mm2能量SW处理细胞效果最明显。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果表明SW可减轻缺血缺氧诱导的H9c2细胞的凋亡,用Hoechest染色方式观察了SW处理对细胞核形态的影响,也表明了SW处理后细胞的凋亡下降,并且在凋亡细胞减少同时细胞内的活性氧产生也明显减少。4、与单纯缺血／缺氧组相比,0.09、0.12mJ/mm2能量SW处理组的H9c2细胞Bax蛋白表达下降,0.12mJ/mm2能量SW处理组的H9c2细胞Cleaved-Caspase-3蛋白表达降低,0.06、0.09、0.12mJ/mm2能量SW处理组的H9c2细胞Bcl-2蛋白表达升高。5、与单纯缺血缺氧组相比,0.06、0.09、0.12mJ/mm2能量SW处理组的H9c2细胞磷酸化AKT蛋白表达升高,并有显著统计学差异(P值均<0.05)。结果提示PI3K-AKT通路可能参与了对SW减轻心肌细胞凋亡的调控。而0.06、0.09、0.12mJ/mm2能量SW处理组的H9c2细胞磷酸化ERK、p38MAPK蛋白与单纯缺血缺氧组比较表达无明显变化,结果提示经过SW处理后,ERK及p38MAPK通路并没有参与SW减轻心肌细胞凋亡的调控。结论：1、缺血缺氧可诱导H9c2细胞发生凋亡,促进细胞内的活性氧产生增多。2、SW可减轻缺血缺氧诱导的心肌细胞的凋亡,降低凋亡相关蛋白Bax及Cleaved-Caspase-3的表达,升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并可减少细胞内活性氧的产生,抑制细胞凋亡。3、PI3K-AKT通路可能参与SW对心肌细胞上述凋亡及抗凋亡蛋白表达的调控作用。
【作者】于玮玮；
【导师】何青；
【作者基本信息】北京协和医学院，心血管内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】体外心脏震波；缺血缺氧；细胞凋亡；

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