还原型β2糖蛋白Ⅰ抑制ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化和凋亡的研究

还原型β2糖蛋白Ⅰ抑制ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化和凋亡的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-29 分类:开题报告 喜欢:4239
师大云端图书馆

【摘要】目的:以动脉粥样硬化(AS)为主要特征的糖尿病大血管并发症,是糖尿病致残、致死的最主要原因。目前动脉硬化发病机制尚未完全明了。AS的发生是一个多种因素在多层次上综合作用的过程。血脂水平的升高伴随着促炎因子的表达和免疫反应的激活,单核细胞活化成为巨噬细胞,血管壁脂质过氧化导致大量ox-LDL生成,巨噬细胞通过吞噬ox-LDL伴随一系列信号分子的表达导致脂质代谢的障碍,并最终形成泡沫细胞。泡沫细胞的形成是AS早期变化的特征性标志,巨噬泡沫细胞的形成及凋亡是动脉粥样硬化斑块损伤形成、发展和崩解的关键。因此探讨影响巨噬泡沫细胞的形成和凋亡的影响因素作为AS治疗的新策略日益受到重视。本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象,通过ox-LDL诱导构建巨噬细胞源泡沫细胞,探讨还原型β2糖蛋白I(R-β2GPI)和β2GPI对AS过程中泡沫细胞形成的影响,以及其可能机制。方法:1.构建RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型,探讨OX-LDL诱导泡沫细胞的合适浓度。巨噬细胞在不同浓度的氧化型低密度脂蛋白溶液内孵育24h,高压液相联合质谱法(HPLC-MS)测定细胞内总胆固醇的含量,MTT法检测细胞生长活力。2.RAW264.7巨噬细胞培养并分四组:①对照组:不加干预因素;②泡沫细胞组:加入80mg/Lox-LDL;③02GPI组:加入80mg/Lox-LDL和100mg/Lβ2GPI;④还原型p2GPI组:加入80mg/Lox-LDL和100mg/L还原型p2GPI。共同孵育24h后,用油红O染色观察细胞形态,HPLC-MS法检测细胞内胆固醇含量,流式细胞技术检测细胞凋亡率研究还原型β2GPI和还β2GPI对巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积和细胞凋亡的影响。3.应用实时定量PCR法研究还原型β2GPI和β2GPI对ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成中CD36、SR-B1、ABCA1、ABCG1等脂代谢相关受体mRNA表达的影响。4.采用WesternBlot技术检测还原型β2GPI和β2GPI对ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成中p38MAPK、JNK/MAPK信号转导通路及其下游促凋亡蛋白关键酶caspase9、caspase3表达的影响。结果:1.随着ox-LDL浓度升高,巨噬细胞内的胆固醇含量逐渐增加。ox-LDL超过25mg/L时细胞活力逐渐下降。ox-LDL浓度在8Omg/L时构建的泡沫细胞内总胆固醇含量适度,油红O染色可见细胞内存在大量脂滴,HPLC-MS检测总胆固醇/胆固醇酯超过50%。细胞活力下降近50%。2.细胞油红O染色、细胞内胆固醇含量检测显示:p2GPI组和还原型β32GPI组巨噬细胞内胆固醇含量明显低于泡沫细胞组(P<0.05,P<0.01),还原型β2GPI组胆固醇酯/总胆固醇(CE/TC)比值较β2GPI组和泡沫细胞组均有降低(P<0.05,P<0.01),且还原型02GPI组胆固醇含量及CE/TC比值较β2GPI组更为减低(P<0.05,P<0.01)。说明还原型β2GPI能够抑制氧化脂质诱导的泡沫细胞形成,其作用比β2GPI组显著。3.流式细胞技术检测细胞凋亡率结果显示:泡沫细胞组细胞凋亡率对照组显著增加(P<0.01);β2GPI组和还原型β2GPI组的细胞凋亡率较泡沫细胞组均明显下降(P<0.05,P<0.01;);总细胞凋亡率较β2GPI组明显下降(P<0.05)。4.Real-timePCR显示还原型β2GPI和β2GPI组较泡沫细胞组巨噬细胞内CD36mRNA明显下降(P<0.05或P<0.01)。还原型β2GPI组CD36mRNA较β2GPI组下降更明显(P<0.05)。而且还原型p2GPI较泡沫细胞组降低ABCA1mRNA表达(P<0.05)。β2GPI组ABCAl与泡沫细胞组无明显差异。各组的ABCG1mRNA、SR-B1mRNA水平无明显差异。5.Westernblot检测结果,ox-LDL能够促进P38MAPK通路磷酸化并激活其下游促凋亡的蛋白关键酶caspase9、caspase3表达,而还原型02GPI与泡沫细胞组相比可以明显下调P38MAPK通路JNK/MAPK通路的磷酸化水平并抑制caspase9、caspase3的表达(P<0.05),从而起到对抗巨噬细胞凋亡的作用。与泡沫细胞组相比,02GPI可以下调JNK/MAPK通路,而对P38MAPK通路的作用没有明显差异。结论:1.以Ox-LDL诱导小鼠RAW2647细胞成功构建巨噬细胞源性泡沫细胞。方法简单简单,可重复性好,成模率高。为体外研究动脉硬化的机制及防治提供了良好的平台。2.还原型β2GPI和β2GPI能够抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成,还原型p2GPI作用比β2GPI更为显著。3.还原型p2GPI和β2GPI能够抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞凋亡,还原型β2GPI作用比p2GPI更为显著。4.还原型p2GPI和β2GPI能够通过减少CD36mRNA水平来减少胆固醇的摄入抑制巨噬细胞内胆固醇的蓄积,防止泡沫细胞形成和凋亡。而还原型02GPI这一作用更为明显。5.还原型β2GPI在ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化中下调P38/MAPK通路、JNK通路的磷酸化水平,并抑制其下游的caspase9-caspase3蛋白表达。
【作者】汪玮琳;
【导师】于德民;
【作者基本信息】天津医科大学,内科学(专业学位),2014,博士
【关键词】β2糖蛋白Ⅰ;还原型β2糖蛋白Ⅰ;动脉硬化;巨噬细胞;丝裂原激活的蛋白激酶;

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