胰岛素基因突变导致糖尿病机制的实验研究

【摘要】目的：本研究旨在探索与人类DM相关的突变型(前)胰岛素原导致糖尿病的分子机制。首先通过定点突变技术构建5个具有不同生物学特性的人突变型(前)胰岛素原质粒h-C(A6)Y、h-L(B11)P、h-C(B19)G、h-R(S6)C和h-F(B25)L,比较各自对共存的人野生型胰岛素原合成和分泌的影响,并利用DelCys突变进一步推测胰岛素分子内二硫键在显性负效应中的作用,比较不同突变型胰岛素原对内质网应激(ERS)相关蛋白的影响,探讨了突变型(前)胰岛素原导致β细胞衰竭的两种相互关联的分子机制,为今后最终阐明糖尿病的发病机理并根治糖尿病提供理论和实验依据。方法：1.通过定点突变技术构建不同生物学特性的突变型人胰岛素原并鉴定,分别转染INS-1细胞,并检测细胞培养液中胰岛素的浓度。(1)以野生型人胰岛素原pCMS-EGFP/h-WT为模板,设计并合成引物,利用定点突变技术,PCR生成pCMS-EGFP/h-C(B19)G、h-L(B11)P、h-R(S6)C、h-F(B25)L、h-C(A6)Y5种单点突变质粒,对每个质粒进行琼脂糖凝胶电泳以及序列测定验证定点突变成功。(2)将不同突变及野生型人胰岛素原通过脂质体2000转染INS-1细胞,并检测不同突变细胞培养液中胰岛素浓度。2.研究人突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原的显性负效应及其机制,探索细胞内堆积的过量胰岛素原对内质网应激相关蛋白的影响。(1)分别将含上述5种突变型人胰岛素原cDNA的重组质粒和含野生型h-WTcDNA的重组质粒单独转染INS-1细胞,转染48小时后,应用双抗体夹心酶联免疫法检测细胞裂解液和细胞培养液中人胰岛素原和胰岛素浓度。(2)分别将含上述5种突变型人胰岛素原cDNA的重组质粒和含野生型h-WTcDNA的重组质粒以及h-WT/vector共转染INS-1细胞,转染48小时后,应用双抗体夹心酶联免疫法检测细胞培养液中人胰岛素浓度。(3)分别将h-WT/DelCys突变(胰岛素原分子中所有六个半胱氨酸残基均被突变,不能形成二硫键)及人野生型和小鼠野生型胰岛素原(h-WT/m-WT)共转染INS-1细胞,检测其细胞内和培养液中人胰岛素原和胰岛素水平。(4)分别将含上述5种突变型人胰岛素原、DelCys突变和h-WTcDNA的重组质粒单独转染INS-1细胞,转染48小时后,各自收集细胞并裂解,免疫印迹法WesternBlot检测细胞裂解液中内质网应激相关蛋白免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、真核细胞转录起始因子α(eIF2α)和磷酸化eIF2α的蛋白表达水平。结果：1.通过定点突变技术构建不同生物学特性的突变型人胰岛素原并鉴定,分别转染INS-1细胞,并检测细胞培养液中胰岛素的浓度。(1)琼脂糖凝胶电泳结果证实：5个定点突变产物分子量位置正确。测序结果证实：5个突变位点密码子置换正确,定点突变技术获得含有5种突变型人胰岛素原cDNA的重组质粒成功。(2)成功培养大鼠胰岛素瘤INS-1细胞,分别将突变及野生型胰岛素原质粒转染INS-1细胞,转染优化条件为质粒：脂质体2000用量分别lug:2uL(24孔板),h-C(B19)G、h-L(B11)P、h-C(A6)Y组细胞培养液中胰岛素浓度低于h-R(S6)C、h-F(B25)L及h-WT组,差别有统计学意义(P<0.05),而h-C(B19)G、h-L(B11)P、h-C(A6)Y组间比较差异无统计学意义(P>0.05),h-R(S6)C、h-F(B25)L及h-WT组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.研究人突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原的显性负效应及其机制,探索细胞内堆积的过量胰岛素原对内质网应激相关蛋白的影响。(1)与h-WT相比,5个突变组细胞裂解液中胰岛素原浓度差异无统计学意义(P>0.05)。而在细胞培养液中,H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-C(A6)Y组胰岛素浓度低于H-R(S6)C、H-F(B25)L及h-WT组,差别有统计学意义(P<0.05),H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-C(A6)Y与vector组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)与h-WT/vector组相比,共转染的h-WT/H-C(B19)G、h-WT/H-L(B11)P、h-WT/H-C(A6)Y组细胞培养液中人胰岛素水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与h-WT共转染的DelCys突变(胰岛素原分子中所有六个半胱氨酸残基均被突变,不能形成二硫键),其细胞内和培养液中人胰岛素原及胰岛素水平与h-WT/m-WT相比差异无统计学意义(P>0.05)。(4)与h-WT组相比,转染突变型胰岛素原h-C(B19)G、h-L(B11)P、h-C(A6)Y的细胞中BiP蛋白表达明显增强、eIF2a蛋白磷酸化水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。突变型H-R(S6)C、H-F(B25)L未影响细胞内BiP表达和eIF2α蛋白磷酸化水平,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.以pCMS-EGFP/h-WTcDNA为模板,通过定点突变技术合成了具有不同生物学特性的突变型胰岛素原,用于突变型胰岛素导致糖尿病机制的实验研究中。2.胰岛素原质粒可以通过脂质体瞬时转染INS-1细胞,转染效率稳定。3.与新生儿糖尿病相关的h-C(B19)G、h-L(B11)P、h-C(A6)Y突变显著降低了共表达的h-WT胰岛素原的分泌,对共存的野生型胰岛素原具有显性负效应,导致大量异常的胰岛素原分子堆积在内质网中。突变型胰岛素原-Delcys尽管造成严重的错误折叠,引起细胞ERS和UPR信号传导通路的激活,但并未影响共转染的野生型胰岛素原的合成及分泌,提示显性负效应的发生机制可能与二硫键有关。4.大量未分泌的异常胰岛素分子堆集在内质网中,引起细胞ERS,激活PERK-eIF2a-ATF4信号传导通路。这3个突变可能是通过显性负效应和ERS两种途径导致胰岛p细胞衰竭的。5.可致成年发病的突变h-F(B25)L、h-R(S6)C2种突变对共存的野生型胰岛素无明显负效应,也未见内质网应激蛋白的表达,推测可能是突变生成的异常胰岛素分子与受体结合能力下降致病。
【作者】张红艳；
【导师】冯凭；
【作者基本信息】天津医科大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】β细胞功能衰竭；定点突变技术错；误折叠的胰岛素原；显性负效应内质网应激；非折叠蛋白反应；

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