基于肽质量指纹谱的病原微生物识别及分型研究

【摘要】基于肽质量指纹谱(peptiedmassfingerprinting,PMF)的微生物识别技术是近年来新兴的微生物鉴定技术体系,自从布鲁克公司的Biotyper系统面世以来,PMF技术不断地在各个领域接受验证与评价。因商业化数据库在高致病性的病原微生物相关信息方面的不足,致使许多病原无法识别或识别不理想；目前为止,没有PMF用于病原分型与溯源的流行病学研究,而PMF快速、高通量的特性非常适合于传染病预防与控制,有望成为有效的诊断工具。商业化参考谱数据库主要基于欧洲病原建立,由于地域性因素,我国某些病原基本不识别或识别率低,并且数据库缺乏高致病性病原,严重限制其在传染病预防控制领域的应用。我国自主知识产权的基于PMF的微生物识别系统尚属空白,国内市场不断被国外公司占据,自主知识产权的识别软件系统研发有关国家的重大利益与安全。因此,结合目前PMF的研究现状,本课题拟对PMF技术条件标准化、数据库构建与评价、基于PMF的流行病学、重组病原及体液病原检测方法建立、自主知识产权微生物识别系统开发等四部分进行研究,推进与实现PMF在传染病预防控制领域的应用。在PMF技术条件标准化上,本研究确定,针对商业化的系统,所有菌株都采用预提取法,除芽孢菌采用80%三氟乙酸提取,其它菌均采用乙醇/甲酸预法处理；液体培养的细菌采用一次PBS洗涤后预提法,可满足敏感性与生物安全性的要求,确定现有PMF系统的检测限为10000个细胞。在细菌传代过程中,2,000～20,000Da小肽系列相对保守,即使有个别变化也不会影响依据整体肽系列匹配率的细菌识别判断。因此,在构建标准肽质量参考谱时,无需考虑菌株的代数。采用标准化的技术条件,本研究构建了31个属、94(86种细菌、6种支原体、2种螺旋体)个种的1019株(细菌886、支原体64、螺旋体69)病原菌的肽质量参考谱,属、种识别能力分别提高了28.2%、42.3%。特异性研究揭示了基于PMF技术在属、种水平上可能错误识别的菌株,共涉及8个属、25个种的病原菌；地域性分析指出10个具有地域性特征的病原。为PMF在临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全、口岸质检等领域的应用提供了技术基础。针对PMF分型与溯源,本研究选用高自然变异性的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)、基因组最小、分型简单的肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)以及16SrRNA核糖体分型的钩端螺旋体(Leptospira)作为模式菌进行基于PMF的分型研究,探索创建种更为快速、实用的分型技术。进而,将PMF技术用于化脓性链球菌(streptococcuspyogenes,groupAStreptococcus,GAS)引起的猩红热疫情爆发的流行病学实战分析。本研究采用PMF技术将HP分为P1、P2两个型别,确定了9个HP型别相关的特征肽。非标定量分析共发现30个型别相关的差异蛋白,生物信息学分析显示P1、P2型HP自身蛋白水平在趋化性、离子调控、双组分系统、分泌系统、代谢系统都有显著的不同,势必影响信号转导通路,其作用将影响宿主细胞的增殖或凋亡而导致不同的病理趋势,为后续的PMF型别作用的分子机制及与疾病的相关性研究提供了基础。针对肺炎支原体,本研究构建了遗传算法(GA)数学模型区分1型和2型MP,其结果与p1基因分型完全一致。模型的敏感度、特异性均为100%。确定了7个具有型别区分能力的特征肽,提供了一系列用于制备MP快速分型试剂盒的生物标志蛋白,并为MPPMF分型机制的揭示提供线索。针对钩端螺旋体,采用基于PMF的MSP聚类分析将钩端螺旋体按其致病性归为两大类,与16SrRNA参考方法分型结果完全一致。通过提取致病性、非致病性菌株的共性特征谱,本研究在Biotyper中引入了超级谱的概念,其致病性区分特异性为100%。采用Label-free技术共发现108个致病性相关的差异表达蛋白。在前期研究的基础上,本研究将PMF技术用于2011年猩红热疫情爆发。快速检测了猩红热爆发区哈尔滨、青岛、济南的298例猩红热及咽峡炎病人咽拭子样本的p溶血分离株,准确地从157个疑似菌株中识别了127株GAS。PMF的测试周期比传统的杆菌肽(BST)或API20缩短了36-48小时,识别能力提高5.5%。菌株匹配参考谱的emm型别分布提示本次猩红热爆发主要由emm12型GAS引起的,与后续emm分型研究结果完全一致。因此,快速、准确、自动化高通量的模式,使PMF完全可以取代传统的GAS分子分型方法,用于猩红热的临床诊断和疫情监测。针对新发病原与人工改造微生物的检测,本研究将PMF技术用于克隆表达重组菌的识别,建立一种克隆表达过程中各阶段表达体的快速分类识别方法。通过构建四维分类数学模型,将克隆表达过程的重组病原分阶段识别。最优GA模型的交叉验证及识别能力评价分别为98.7%、100%,数据验证的准确率为95%。采用表达鼠疫蛋白的重组子构建的分类模型对空肠弯曲菌、幽门螺杆菌的重组子具有同样的分类识别能力,是一种通用的模型。针对体液中病原检测的现状,本研究以布鲁氏菌菌血样本为例,采用PMF构建了布鲁氏菌特征肽质量指纹谱模型,确定了8个特征指纹肽。用该模型检测32例疑似临床病人的菌血,10例为布鲁氏菌阳性,与Tb噬菌体特异裂解实验结果一致。本研究所构建的病原肽质量谱数据库成功用于我国第一套具有独立知识产权的PMF微生物识别软件——微生物检测系统(简称MicroID系统或微检系统)(version1.0)的研发和应用。总之,本研究进行PMF技术条件的标准化、批量构建病原微生物参考谱并进行系统分析,并将构建的数据库成功用于我国第一套具有独立知识产权的PMF微生物识别系统。探索了基于PMF的病原微生物分型方法,并将PMF技术用于实际疫情爆发处理中,为PMF技术在公共卫生领域的使用提供了方法、理论依据和范例。同时创造性地将PMF技术用于重组病原的识别、体液中病原体的快速检测,构建了切实可行的方法。
【作者】肖迪；
【导师】张建中；
【作者基本信息】中国疾病预防控制中心，病原生物学，2014，博士
【关键词】肽质量指纹谱；病原微生物；鉴定；分型；微生物鉴定系统；

【参考文献】
[1]展亮.泰安市农村合作银行安全保卫信息管理系统设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[2]梁文星.Ⅰ紫藤脉花叶病毒的鉴定及其全序列测定 Ⅱ新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达与活性测定[D].中国农业大学,植物病理学,2004,硕士.
[3]李丹,梁吉,孙荣富,刘军,刘国旗,陈之栩,韩福坤.并网电厂管理考核系统中AGC调节性能补偿措施[J].电力系统自动化,2010,04:107-111.
[4]林自强.应用速度谱解释岩性[J].石油地球物理勘探,1979,02:51-57.
[5]李磊.罕遇地震作用下楼梯对不规则框架结构抗震性能影响的研究[D].兰州理工大学,土木工程,2014,硕士.
[6]赵明昊.冠状动脉旁路移植术术前抑郁筛查及他汀对术后早期抑郁的影响[D].北京协和医学院,临床医学,2014,博士.
[7]刘卓婧.铈掺杂氧化铋光催化剂的制备及其可见光光催化性能研究[D].吉林大学,环境工程,2014,硕士.
[8]郭琳.中国钢铁企业国际铁矿石谈判失利原因分析[D].吉林大学,国际商务（专业学位）,2014,硕士.
[9]刘晓薇.汉英名量词对比及对外汉语量词教学策略[D].鲁东大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[10]张媛媛.董事对第三人损害赔偿责任研究[D].华东师范大学,经济法学,2013,硕士.
[11]洪屿.番禺沙湾古镇的历史原真性保护[D].华南理工大学,建筑学（专业学位）,2012,硕士.
[12]谢海霞.结构性理财产品的风险评估研究[D].浙江大学,2013.
[13]张延.不同负荷的肌收缩过程中动作反应时变化特征[D].苏州大学,运动人体科学,2012,硕士.
[14]谭智威.艾灸配合辨证中药防治化疗相关性腹泻的临床研究[D].广州中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[15]张春旭.嵌入式网络视频监控系统的设计[D].大连海事大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[16]任向宁.农用地资源价值核算与可持续利用[D].河北师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[17]邱阳.球形玻璃基底表面增透ITO导电膜的研究[D].中国建筑材料科学研究总院,材料学,2012,硕士.
[18]武薇.供应链突发事件风险对企业绩效的影响研究[D].北京交通大学,2014.
[19]张吴钰.从认知角度谈《诗经》词汇翻译[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[20]王玉华.黄河QD352型载货汽车大修可靠性研究[D].大连理工大学,动力工程,2003,硕士.
[21]杨虹.西安某村城中村改造工程的探讨与实践[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[22]吕新丽.几类具有扩散和脉冲的捕食系统的研究[D].山西师范大学,应用数学,2014,硕士.
[23]王树甲.GSM数字蜂窝移动通信系统主要技术特性(一)[J].现代电信科技.1996(07)
[24]王文秀.无线传感器网络自定位算法研究[D].东北石油大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[25]桂世勋.受贿罪死刑适用标准研究[D].西南政法大学,刑法学,2012,硕士.
[26]马德堂,朱光明.弹性波波场P波和S波分解的数值模拟[J].石油地球物理勘探,2003,05:482-486+458-582.
[27]熊麟.基于学缘的中国科学院院士成长特征研究[D].西南交通大学,科学技术哲学,2013,硕士.
[28]潘利东.棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率检测和对常用杀虫剂的抗性监测[D].南京农业大学,农药学,2013,硕士.
[29]申长念.X型磺酸盐Gemini表面活性剂与单链表面活性剂复配体系的研究[D].中北大学,应用化学,2013,硕士.
[30]任辉辉.冶炼烟气制酸中稀硫酸浓缩技术的研究及工业装置的设计与应用[D].湖北师范学院,分析化学,2013,硕士.
[31]徐广民,王华忠,范华,辛可峰,吴国忱,陈猛.复杂介质常梯度射线追踪方法研究[J].石油地球物理勘探,2004,03:265-270+243-244+369.
[32]解菡.肯德基经营模式的跨文化解读[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[33]周云.钢铁行业废旧除尘布袋污染特征及回收利用试验研究[D].广东工业大学,环境工程,2012,硕士.
[34]涂春云.硼杂富勒烯—超碱体系的非线性光学性质的理论研究[D].吉林大学,物理化学,2014,硕士.
[35]张旭亮.新疆绿色食品产业发展初步探讨[D].新疆师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[36]王建明.明清没骨画对当代没骨画发展的影响[D].北京服装学院,美术学,2012,硕士.
[37]宋伟.高职院校计算机网络技术专业项目式教学应用研究[D].华中师范大学,教育管理,2014,硕士.
[38]张跃跃.中美产前教育比较研究[D].华东师范大学,成人教育学,2013,硕士.
[39]任磊.棉花图像分割算法研究[D].新疆大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[40]刘建叶.乙烯基酯树脂乳液碳纤维上浆剂的制备与性能研究[D].济南大学,材料加工工程,2012,硕士.
[41]李道强.地源热泵空调系统的技术经济评价及地热换热器优化研究[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2004,硕士.
[42]吴玉香,胡跃明.一类不确定非完整移动机械臂的鲁棒镇定[J].控制与决策,2006,11:1289-1292+1297.
[43]宋丽芝.晋西黄土丘陵沟壑区人口容量与区域经济可持续发展研究[D].山西大学,自然地理学,2004,硕士.
[44]钟军,禹龙,田生伟,吐尔根·依布拉音.基于双层模型的维吾尔语突发事件因果关系抽取[J].自动化学报,2014,04:771-779.
[45]姚思程.中国上市公司评价体系研究[D].北京交通大学,会计,2013,硕士.
[46]张德林.二连盆地的逆断层运动及其对油气藏形成的影响[J].石油地球物理勘探,1994,05:637-641+668.
[47]宋宇.机载吊舱光学系统方案论证与设计[D].哈尔滨工业大学,光学工程,2014,硕士.
[48]马行坡.无线传感器网络中安全高效的Top-k查询算法研究[D].中南大学,计算机应用技术,2013,博士.
[49]刘佳.适老型住宅价值链及价值创造研究[D].西安建筑科技大学,工业工程,2013,硕士.
[50]李芳.FDI对中国发展低碳经济的影响[D].沈阳理工大学,国际贸易学,2012,硕士.