肝癌的整合组学研究以及新发种系拷贝数变异研究

【摘要】第一部分：肝癌的整合组学研究肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）（简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，也是世界范围内位居第三的癌症死亡原因。由于对肝癌的发病机理仍不十分清楚，目前尚无有效的治疗手段。发现和鉴定新的肝癌相关基因，揭示其作用机制，能为肝癌新的防诊治措施的研发提供理论依据。microRNA（miRNA）是一种长度大约在22~24碱基的内源性非编码小RNA，通过转录后抑制其靶mRNA的表达起调控作用，据估计大约30%的人类编码基因受到miRNA的调控。miRNA的异常在肝癌等肿瘤的发生发展中起重要作用。为了发现新的肝癌相关的miRNA，首先，我们对40例肝癌的癌组织和配对癌旁组织样本进行了小RNA高通量测序，经过一系列的质量控制后，共鉴定到1030个miRNAs，其中119个miRNAs在癌和癌旁组织间显著差异表达（上调64个，下调55个）。同时，我们采用基因芯片技术获得了这40对组织样本的mRNA表达谱。随后，我们采用基于miRNA-mRNA表达相关性的基因集富集分析（Genesetenrichmentanalysis，GSEA）和双向聚类（biclustering）分析相结合的“整合组学”分析策略，对上述两个表达谱数据进行了整合分析共发现了10个与肝癌发生发展密切相关的功能模块，其中共包含了73个miRNAs和1809个基因富集项。我们进而对这10个模块进行了功能注释，发现它们对应的功能分类主要包括代谢、细胞周期、免疫反应、ECM、蛋白酶体、tRNA氨酰化、线粒体能量代谢、血液凝结、E2F靶基因和SRF靶基因。最后，我们分别选择了对细胞周期模块中的miR-1306和ECM模块中的miR-424*进行了功能验证。在肝癌细胞系HepG2中过表达miR-1306后确实可以显著增加细胞的S期，而抑制miR-424*的表达则可显著抑制细胞的迁移能力，从而验证了我们前述的“整合组学”分析结果。因而可以期望，对其它模块中的miRNAs进行系统的功能研究，将发现一系列新的与肝癌发生发展密切相关的miRNAs。除了单碱基变异（Singlenucleotidevariation，SNV）外，拷贝数变化（Copynumberalteration，CNA）是基因组中另一常见的变异类型。CNA通过改变基因组DNA的拷贝数而影响基因的表达剂量或编码蛋白的结构，从而影响基因的功能。有些CNA可能影响肿瘤相关基因的表达剂量或蛋白结构，因而与肿瘤的发生发展密切相关。过去人们主要通过比较基因组杂交（Comparativegenomichybridization，CGH）芯片和SNP分型芯片发现基因组中的CNA，但这些方法发现的CNA缺乏基因的表达数据作为佐证。为了发现与肝癌相关的CNA，我们采用了基于基因表达数据的拷贝数变化分析（AnalysisofCNAsbyexpressiondata，ACE）方法，对40例肝癌组织及其配对癌旁组织的mRNA表达谱数据进行了CNA的推算。同时，运用ACE方法对前人发表的另外5个独立的肝癌组织mRNA表达谱数据也进行了CNA的推算。根据上述6个mRNA表达谱数据我们共发现了15个共有的显著的CNA区域，其中8个是显著扩增区域：1q21.2-q21.3、1q21.3-q22、1q32.3-q41、1q41-q42.12、1q42.13-q42.2、8q24.13、8q24.3和20q11.21-q11.22，7个是显著缺失区域：4q13.2-q13.3、4q21.3-q23、4q25、4q31.3-q32.3、8p21.3-p21.2、12p13.31-p13.2和16q12.2-q13。我们随后对这15个CNA区域进行了生存分析，发现只有其中的8q24.13扩增区域与肝癌患者的总体生存率和无病生存率均显著相关（P<0.05），提示8q24.13与肝癌的发生发展密切相关。随后，我们采用高内涵筛选实验对8q24.13区域中的12个基因进行了功能研究，发现其中的ATAD2基因和WDR67基因具有显著的促进肝癌细胞系增殖和迁移的能力，提示其可能是8q24.13中真正有功能意义的肝癌相关基因。总之，我们基于肝癌组织的mRNA表达谱和miRNA表达谱组学数据，采用整合组学的分析策略，发现了一系列与肝癌发生发展相关的miRNA和CNA。对这些miRNA和CNA中的基因进行深入的功能和机制研究，将为后续肝癌诊断及预后的标志物和候选药靶的研发奠定基础。第二部分：肝癌的新发种系拷贝数变异研究肝癌属于多基因复杂疾病，是遗传因素和环境因素交互作用的结果。近些年来，以单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）和拷贝数变异（Copynumbervariation，CNV）为遗传标记的全基因组关联研究（Genome-wideassociationstudy，GWAS）揭示了一系列与肝癌发生风险密切相关的候选基因。然而，这些候选基因仅能解释很小比例肝癌患者的遗传风险，大部分肝癌患者的遗传病因仍有待发现。除了上述SNP和CNV这些可遗传的风险因素外，最近，在配子期发生的新发遗传变异（denovovariation）引起了人们的关注。为了探讨新发的拷贝数变异（denovoCNV）对肝癌的发生风险的影响，我们采用IlluminaHumanOmniZhongHua-8BeadChip芯片对205个肝癌核心家系进行了SNP的分型。随后，我们采用PennCNV方法进行了CNV的推算和和denovoCNV的检测，结果在205个肝癌核心家系中共发现了11个denovoCNV，人群频率大约为5.4%（11/205），显著高于文献报道的健康对照家系的频率1.72%（OR=3.19，P=0.002）。其中，位于16p13.3区域的denovoCNV出现在两个肝癌家系中，其影响的编码基因为RBFOX1。我们进而在295个肝癌散发病例和1479个非肝癌对照中对上述11个denovoCNV进行了人群验证，又在另外两个肝癌病例中分别发现了CNV，分别位于8p22和11q25区域。上述基于肝癌核心家系denovoCNV研究，证实了denovoCNV对肝癌的发生风险也具有显著的影响，约可解释4%的人群归因风险，是肝癌发生的一种新的遗传病因类型
【作者】曹鹏博；
【导师】周钢桥；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，遗传学，2014，博士
【关键词】miRNA；拷贝数变化；肝癌；整合组学；ACE；GSEA；Biclustering；denovoCNV；16p13.3；RBFOX1；

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