黑色素瘤细胞表达的LSECtin抑制抗肿瘤T细胞免疫反应并促进小鼠黑色素瘤的生长

【摘要】因为在黑色素瘤病人肿瘤组织内能发现大量的肿瘤浸润淋巴细胞，所以黑色素瘤相比较其他类型的肿瘤更具免疫原性。即便如此，针对于黑色素瘤的免疫疗法大多会失效，其主要原因是在这些黑色素瘤病人体内肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞大多失去了应有的效应功能。目前有很多研究都致力于揭示导致这些肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞失去其效应功能的内在机制。这些机制主要包括：肿瘤细胞破坏抗原提呈细胞的功能；下调抗原提呈细胞HLA分子的表达；上调肿瘤微环境中的抑制型因子，包括IL-6和IL-10等细胞因子；招募更多的抑制型细胞，例如调节性T细胞（regulatoryTcells，Treg）和髓样起源的抑制型细胞（myeloid-derivedsuppressorcells，MDSC）到肿瘤微环境中。近年来，T细胞免疫反应共抑制分子的功能和应用研究逐步受到重视。肝脏和淋巴结窦内皮细胞粘附分子（LiverSinusoidalEndothelialCellLectin，LSECtin）是我们实验室从肝脏中发现的II型跨膜C型凝集素受体，前期研究表明其特异的表达在肝脏和淋巴结中的窦内皮细胞。其主要功能包括作为T细胞免疫反应的共抑制分子，在肝脏内抑制HBV病毒的清除，从而促进肝脏对HBV的耐受。从免疫学的角度看，抗肿瘤免疫反应和慢性病毒感染免疫反应有许多类似之处，因此，我们想知道LSECtin作为T细胞免疫反应的共抑制分子，是否抑制抗肿瘤免疫反应？首先通过检测包含有7种肿瘤组织RNA芯片中LSECtin的表达，来筛选其中高表达LSECtin的肿瘤类型，我们发现黑色素瘤病人中LSECtin表达量较高，且大约有30%左右的病人相对于正常人来说，其LSECtin表达量明显上调。接下来，我们进一步检测黑色素瘤病人组织RNA芯片中LSECtin的表达，在共计40例黑色素瘤病人组织中，有大约20例病人组织中LSECtin表达量相对于正常人的表达量明显上调。在RNA水平上确认了黑色素瘤病人组织中表达LSECtin之后，我们进一步从蛋白质水平，采用免疫组织化学法检测到黑色素瘤病人组织芯片中也表达LSECtin，同时采用流式分析法检测到黑色素瘤病人的术后新鲜黑色素瘤细胞表面也表达LSECtin。至此，我们确认黑色素瘤病人组织的确表达LSECtin。国际上用于研究人黑色素瘤最好的动物模型是给C57BL/6小鼠接种B16细胞，因此我们需要检测B16细胞中LSECtin的表达情况。我们发现不论是RNA水平还是蛋白质水平，B16细胞中LSECtin的表达量都非常低，但是接种到小鼠体内的B16细胞在形成肿瘤之后，其LSECtin表达量明显上调，这也就提示我们很可能是肿瘤微环境会诱导B16细胞上调LSECtin的表达。通过获取小鼠黑色素瘤的组织提取物溶液模拟生理性的肿瘤微环境，我们发现其的确能够上调LSECtin的表达，并且通过相应的抗体封闭实验表明可能是肿瘤微环境中的IL-6和IL-10介导了这一上调。并且，外源的重组细胞因子IL-6和IL-10同样能够上调B16细胞LSECtin的表达。在确认B16细胞本底表达LSECtin较低且在体内肿瘤微环境中会被诱导上调这一现象之后，我们构建了相应的B16细胞过表达LSECtin的稳定株B16-LSECtin及其对照稳定株B16-mock。首先，我们确认这两株细胞在体外的生长能力并无差异。接下来通过给野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接种B16-LSECtin或者B16-mock细胞，我们发现无论是野生型还是LSECtin敲除型的小鼠，接种B16-LSECtin细胞之后，其生长速度明显快于接种B16-mock细胞的小鼠。为了确认这一现象是否依赖于LSECtin，我们给野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接种B16细胞，再同时注射LSECtin的抗体，我们发现无论是野生型还是LSECtin敲除型的小鼠，接种B16细胞之后，如果注射了LSECtin的抗体，其肿瘤生长速度明显慢于注射对照抗体的小鼠。这些结果提示我们B16细胞表达的LSECtin会促进小鼠黑色素瘤的生长。结合LSECtin的现有功能研究，我们猜想是否肿瘤细胞表达的LSECtin通过抑制T细胞抗肿瘤免疫反应来促进小鼠黑色素瘤自身的生长。为了检验这一假设，我们首先对接种B16-LSECtin或者B16-mock细胞的小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学分析，发现二者肿瘤细胞的增殖情况和凋亡情况均无明显差异，这就提示我们二者肿瘤生长速度的差异与肿瘤细胞自身的生长情况无关，而可能与机体的T细胞抗肿瘤免疫反应有关。因此，我们采用CD4和CD8分子的抗体，来清除小鼠体内的CD4+或者CD8+T细胞，然后再分别接种B16-LSECtin或者B16-mock细胞，我们发现CD4+或者CD8+T细胞不存在的情况下，LSECtin过表达之后并不能使小鼠黑色素瘤的生长加快，这也就提示我们的确肿瘤细胞表达的LSECtin需要与T细胞相互作用来发挥其抑制功能，从而间接促进肿瘤自身的生长。为了进一步明确肿瘤细胞表达的LSECtin是如何来抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应，我们从两个方面着手：其一是否会影响T细胞的增殖，导致肿瘤内T细胞数目减少？其二是否会直接影响T细胞的效应功能？通过分离检测小鼠肿瘤浸润淋巴细胞中各种类型T细胞的比例，我们发现接种B16-LSECtin细胞的小鼠，其肿瘤浸润淋巴细胞中CD3+和CD8+T细胞的比例明显低于接种B16-mock细胞的小鼠。通过相应的体外共培养实验，也表明LSECtin能够抑制CD8+T细胞的增殖，但是不影响其凋亡。接下来，我们先给野生型C57BL/6小鼠接种B16-LSECtin和B16-mock细胞，再分离其肿瘤引流淋巴结细胞以及脾脏细胞，分别使用IFN-γ胞内细胞因子染色法（ICS）和酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测这些细胞的效应功能。我们发现小鼠接种B16-LSECtin细胞之后，其肿瘤引流淋巴结细胞以及脾脏细胞的效应功能明显减弱。另一方面，我们采用体外共培养的实验体系，也表明肿瘤细胞表达的LSECtin能够抑制CD8+T细胞IFN-γ的释放。这些数据提示我们肿瘤细胞表达的LSECtin不仅可以抑制T细胞的增殖，导致肿瘤内T细胞数目减少，还能直接削弱肿瘤内T细胞的效应功能，从而整体上减弱机体的抗肿瘤免疫反应，促进自身生长。在发现LSECtin的这一功能之后，我们想知道肿瘤细胞表达的LSECtin是与T细胞表达的什么分子进行相互作用，来介导这一功能呢？通过对免疫抑制型受体相关文献的挖掘并结合PRINCESS生物信息学工具的预测，我们获得了几个可能与LSECtin相互作用的分子，并通过表面离子共振法（SPR）筛选到其中LAG-3可以作为LSECtin相互作用蛋白的候选分子。接下来，我们分别从物理上的相互作用，包括免疫共沉淀法（Co-immunopreiciation，Co-IP）、酶联免疫吸附法（ELISA）以及细胞粘附实验确认了LAG-3能够与LSECtin发生物理上的相互作用。从功能上，通过使用LAG-3的封闭性抗体，我们发现将LAG-3封闭之后，不论是外源的重组LSECtin，还是肿瘤细胞表达的内源LSECtin，其对T细胞效应功能的抑制均得到一定程度的回复。这些数据提示我们肿瘤细胞表达的LSECtin很有可能是与T细胞表达的LAG-3发生相互作用，从而抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应，从而间接促进肿瘤自身的生长。综上所述，我们的研究结果显示：LSECtin是表达在黑色素瘤细胞表面的共抑制分子，抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的生长。LAG-3是表达在T细胞表面的共抑制分子，LSECtin可能与LAG-3相互作用抑制T细胞IFN-γ的分泌。LSECtin在黑色素瘤中的功能研究，揭示了机体对于黑色素瘤免疫耐受的一种新的分子机制。
【作者】徐锋；
【导师】贺福初；唐丽；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】LSECtin；黑色素瘤；免疫共抑制分子；

【参考文献】
[1]本报记者史晓菲.超级电池真来了？[N].消费日报,2015-03-26A01.
[2]李英.广西生态移民区土地利用变化对土壤质量的影响[D].中国地质大学（北京）,资源管理工程,2014,硕士.
[3]安春玲.基于Ag-M纳米催化剂的制备及其对苄氯的电催化研究[D].湖南大学,2012.
[4]范明月.益心舒胶囊联合米氮平治疗卒中后抑郁临床研究[D].河北医科大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[5]袁艳冰.喉罩通气与面罩通气在新生儿复苏的随机对照研究[D].广州医科大学,儿科学,2014,硕士.
[6]李永祥,曹端林,王建龙,耿天奇.向日葵秆制备刨花板工艺研究[J].林产工业.2006(02)
[7]武云霞.义务教育学生申诉制度研究[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[8]邢怀龙.美国专利保护制度研究[D].中国社会科学院研究生院,国际经济法（专业学位）,2014,硕士.
[9]谢春艳.越南留学生汉语敬词语用偏误分析[D].广西民族大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[10]肖艳.中国与中低收入发展中国家经贸合作新战略研究[D].对外经济贸易大学,世界经济与政治,2014,博士.
[11]生庆海.市场多广价值多大制约因素中国婴幼儿奶粉市场三问[J].乳品与人类.2003(06)
[12]王波.中国收入分配与经济增长关系研究[D].华东师范大学,政治经济学,2004,硕士.
[13]刘辉.富锂锰基固溶体正极材料Li_(1.2)Ni_(0.13)Co_(0.13)Mn_(0.54)O_2的制备及改性研究[D].哈尔滨工业大学,化学工程与技术,2014,硕士.
[14]郑文杰.科技型新创企业创业团队外部社会网络对创新绩效的影响研究[D].江南大学,企业管理,2012,硕士.
[15]石丹,李涛.基于低碳经济理念的大学校园节能思考[J].现代物业(中旬刊),2012,07:122-124.
[16]张国伍.交通运输清洁能源的发展与应用——“交通7+1论坛”第三十八次会议纪实[J].交通运输系统工程与信息,2015,02:1-9.
[17]周全.论基于知识管理的社科信息服务[J].中国图书馆学报,2004,02:40-43.
[18].国家自然科学基金委员会生命科学部2012年度青年科学基金项目[J].生命科学,2012,12:1443-1487.
[19]刘恒昌.新型环氧树脂的合成、结构和性能研究[D].吉林大学,有机化学,2014,硕士.
[20]蔡昕.基于相对位置的Web生活服务信息的组织与可视化研究[D].华中师范大学,情报学,2014,硕士.
[21]郝海峰.高可靠性遥测加密模块研究[D].西安电子科技大学,控制工程,2011,硕士.
[22]赵景欣.试论行业职业教育及其改革发展的动力[J].中国培训.1995(09)
[23]曹平.调节性树突状细胞对哮喘小鼠气道炎症及IL-12、IgE分泌的影响[D].泰山医学院,老年医学,2012,硕士.
[24]邱勇.交通相关PM2.5对人群外周血细胞因子的影响及钙信号通路调控研究[D].山西医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2013,硕士.
[25]JIGDOLMA.GUNCHIN-ISH（吉格）.扎门乌德边境物流中心项目建设研究[D].北京交通大学,2014.
[26]吕天春.高职院校商务英语教学中存在的问题及对策研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[27]张雷.基于internet的自动车床凸轮组远程协同设计系统的研究与开发[D].苏州大学,机械设计及其理论,2003,硕士.
[28]赵萍,马江宝.论图书馆的知识服务及其实现[J].图书馆学研究,2005,08:32-35.
[29]闫兴亚.基于网络的自主学习模式设计与应用研究[D].西北师范大学,教育技术学,2003,硕士.
[30]唐红叶.发酵法生产β-胡萝卜素的搅拌反应器的流场分析[D].河北工业大学,化学工程,2013,硕士.
[31]张志兴.鼻咽非角化鳞状细胞癌组织内浸润的T淋巴细胞的表达及意义[D].广西医科大学,病理学,2013,硕士.
[32]陈娟娟.磷在高岭土、腐殖酸及海洋沉积物上的吸附行为研究[D].中国海洋大学,海洋化学,2014,硕士.
[33]何展翔,王绪本.油气藏电性异常模式与电磁法油气检测[J].石油地球物理勘探,2007,01:102-106+132+125.
[34]田原曦.“反规划”理论在文化遗产保护规划中的应用[D].西北大学,考古学及博物馆学,2014,硕士.
[35]王彩霞.鲢鱼脑的营养评价及生理活性研究[D].江南大学,食品科学,2014,博士.
[36]翟伟娜.基于神经网络滑模多自由度机械手轨迹跟踪算法研究[D].河南科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[37]张玉梅.企业环境财务信息披露与企业价值的关系研究[D].湖南师范大学,企业管理,2013,硕士.
[38]常战芳,安丰涛.宣钢高、焦炉煤气计算机网络监测系统[J].冶金自动化,2004,02:51-53.
[39]笪建.基于Android的物流业务移动终端系统的分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[40]李越明.男权隐忧：007电影中的男性神话[D].广东外语外贸大学,英语语言文学,2004,硕士.
[41]王占.生物治疗联合索拉菲尼的序贯疗法疗效研究[D].兰州大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[42]蒋义意.二十二碳六烯酸甘油酯微囊的制备工艺及其稳定性的研究[D].浙江工业大学,2013.
[43]刘连江.垂直潜流人工湿地优化设计与运行研究[D].山东建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[44]奚海清.民事审判监督程序的反思与改造[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[45]李继林,董怀晶,王璐.高校吸引力要素模型构建研究[J].教育理论与实践,2014,27:3-5.
[46]周志勇.生鲜农产品生产企业供应链融资的风险控制研究[D].湖南师范大学,企业管理,2014,硕士.
[47]毛利慧.KK公司融资优化策略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[48]陈薇.论广东“走出去”战略的理论依据和路径选择[D].中共广东省委党校,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[49]连兴华.抗拔桩基承载性能分析[D].哈尔滨工业大学,岩土工程,2013,硕士.
[50]黄珊珊.我国上市公司自愿性信息披露研究[D].北京交通大学,2012.