ZFP580参与间歇低氧抗大鼠心肌缺血—再灌注损伤的机制研究

【摘要】随着心肌梗死后溶栓或介入治疗、冠状动脉旁路、心脏移植术等医疗技术的发展，心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）损伤的临床发生率日益增加，并成为心血管病人死亡的首要原因，探讨I/R损伤的发生机理并积极寻求其防治手段成为亟待解决的问题。早在上世纪50年代末，人们第一次发现生活在高海拔地区的人群心肌梗死的发生率明显低于生活在平原的人群。随后，有关高海拔缺氧具有心肌保护作用的研究在动物实验水平逐渐开展，科学家们利用低压低氧舱模拟高海拔缺氧进行了大量的研究，并最终证实了慢性缺氧预处理（hypoxicpreconditioning,HPC）的心肌保护作用，验证了这一流行病学观察结果。然而，对于HPC是如何发挥心肌保护作用的，仍是困扰人们的一大难题。本组在先前的工作中获得了一个人类心血管疾病相关新基因ZNF580，并随后获得了鼠源性同源基因ZFP580。在前期对于ZFP580基因功能的研究中发现，ZFP580可能对维持细胞的存活、增殖等生理活动具有明显意义，并且参与L-精氨酸预处理抗大鼠心肌I/R损伤的过程。为了探讨间歇高海拔缺氧（Intermittenthigh-altitudehypoxia，IHAH）预处理对大鼠心肌I/R损伤后的影响及锌指核转录因子ZFP580发挥的作用，本实验从动物整体、细胞、分子三个水平开展了相关研究。一、在整体水平观察IHAH对大鼠心肌I/R损伤及ZFP580表达的的影响：雄性Wistar大鼠随机分为IHAH组和常氧对照组。本课题按照文献报道的方法模拟高原缺氧环境，将IHAH组大鼠置于模拟海拔高度为5000m的低压氧舱中，每天6小时，持续42天。两组大鼠通过结扎左冠状动脉前降支建立心肌I/R损伤模型，检测血清中LDH活性及CK-MB浓度，利用酞菁蓝-TTC染色比较心肌梗死面积，经右颈总动脉插管至左心室测量心室收缩功能，并利用Westernblot方法观察各组大鼠心肌组织中ZFP580的表达及ERK1/2磷酸化的情况。结果显示，经IHAH预处理的大鼠对于心肌I/R损伤的耐受性明显增强，具体表现在：①心肌I/R损伤后漏出至血清的心肌酶LDH活性降低、CK-MB含量减少；②心肌I/R损伤后心肌梗死面积明显缩小；③心肌I/R损伤后心室的收缩功能明显好转。另外，大鼠心肌I/R损伤后，ZFP580mRNA及蛋白表达水平均上调，且蛋白水平的上调发生在再灌注的早期阶段（再灌注2h之前）。并且，ZFP580蛋白表达上调与ERK1/2磷酸化水平升高的起始时间及持续时间具有明显的平行相似性。经IHAH预处理的大鼠心肌组织中ZFP580的表达进一步上调，并且在心肌I/R损伤2h后IHAH组大鼠心肌组织中ZFP580表达仍处于较高水平。可见，本课题采用的IHAH预处理对于大鼠心肌I/R损伤具有明显心肌保护作用。IHAH对心肌组织中ZFP580表达的诱导上调提示ZFP580可能参与了IHAH抗心肌I/R损伤的过程。ZFP580表达与ERK1/2磷酸化水平变化的平行相似性提示ZFP580的表达可能受到ERK1/2信号通路的调控。二、在细胞水平观察ZFP580在HPC抗大鼠心肌细胞模拟缺血/再灌注损伤中的作用在第一部分动物整体实验的基础上，本部分实验在大鼠H9c2心肌细胞进行，旨在通过验证HPC对心肌细胞模拟缺血/再灌注（simulatedI/R，SI/R）损伤的保护作用，观察锌指核转录因子ZFP580表达的改变，并通过观察ZFP580与SI/R损伤诱导心肌细胞凋亡的关系，探讨ZFP580是否参与HPC对心肌细胞的保护作用。来源于大鼠胚胎心肌的H9c2细胞加入经氮气饱和的模拟缺血的缺氧液（PH=6.2），37℃持续缺氧（95%N2+5%CO2）培养3h后换无血清培养基复氧（95%Air+5%CO2)培养，建立心肌细胞模拟缺血/再灌注（SI/R）模型；并通过反复短暂的缺氧-复氧实验建立HPC细胞模型。另外，通过慢病毒介导的基因转染实验，实现在H9c2心肌细胞内高/低表达ZFP580，并通过流式细胞术检测技术探讨ZFP580与SI/R损伤诱导心肌细胞凋亡的关系，进一步探讨ZFP580在保护心肌细胞中发挥的作用。实验结果显示，H9c2心肌细胞在持续3h模拟缺血的缺氧后复氧，细胞存活率下降，细胞内LDH、CK-MB心肌酶释放增加，并且上述细胞损伤表现随着复氧时间的延长进一步加重。这些结果与我们在第一部分实验中观察到的大鼠心肌I/R损伤后的表现一致。另外，本实验采用的HPC方法能有效抵抗SI/R导致的心肌细胞损害，可见，本实验建立的SI/R及HPC的细胞模型与第一部分动物实验模型具有一定的相似性，可以用于模拟动物实验在细胞水平上进行的机制研究。另有实验结果显示，SI/R引起细胞中ZFP580表达水平明显升高，而且ZFP580表达高峰出现在复氧后的早期阶段即复氧后2h之内。HPC可进一步诱导ZFP580表达上调，使ZFP580表达水平在心肌细胞SI/R后2h仍保持较高水平。这些结果提示ZFP580作为心肌细胞自身代偿机制在SI/R早期发挥作用，并可能参与了HPC对抗心肌细胞的致死性损伤的细胞保护机制。实验中利用慢病毒介导的基因转染技术获得了高/低表达ZFP580的H9c2心肌细胞，并进行SI/R损伤实验。通过流式细胞术检测细胞凋亡率的改变，并通过Westernblot检测细胞中活化caspase-3表达情况，分析各组细胞SI/R损伤后细胞凋亡的变化。流式细胞计数结果证实，ZFP580高表达明显减少SI/R损伤后心肌细胞的凋亡率。高表达ZFP580的H9c2心肌细胞在SI/R损伤后，细胞中caspase-3活化减弱，而转染siRNA使ZFP580表达下降的H9c2心肌细胞，SI/R损伤后细胞中caspase-3活化增强。可见，ZFP580具有减轻SI/R损伤后心肌细胞凋亡的作用。ZFP580的抗凋亡的效能可能是其参与HPC细胞保护作用的机制之一。三、在分子水平观察ERK信号通路对转录因子ZFP580表达的调控在第二部分实验的基础上，本部分实验旨在进一步探讨ZFP580可能受到的信号转导调控机制。通过Westernblot方法观察HPC保护心肌SI/R损伤过程中ERK1/2磷酸化的情况，观察应用ERK1/2选择性阻滞剂PD98059（10μM）后对HPC保护作用及锌指核转录因子ZFP580表达的影响，验证ERK1/2信号通路在HPC中的作用，探讨其对ZFP580的调控作用。实验结果显示，SI/R引起细胞中ERK1/2磷酸化水平明显升高，而且HPC使H9c2心肌细胞在SI/R后的ERK1/2磷酸化水平进一步升高。结合本研究在第一部分观察到的，大鼠心肌I/R损伤使心肌组织中ERK1/2磷酸化水平升高，IHAH预处理使心肌I/R损伤后ERK1/2磷酸化水平进一步升高的实验发现，我们推测ERK1/2的磷酸化参与了IHAH或HPC对心肌组织或细胞的保护作用。应用PD98059（10μM）阻滞ERK1/2的磷酸化后HPC的细胞保护效应消失，从而证实了ERK1/2参与HPC心肌细胞保护作用的假设。另外，ERK1/2磷酸化水平升高与ZFP580蛋白表达上调的起始时间及持续时间具有明显的平行相似性，且PD98059预处理能明显抑制SI/R后心肌细胞中ZFP580的表达上调。可见，SI/R或HPC引起的ZFP580表达上调和ERK1/2磷酸化有关，ZFP580作为ERK1/2途径调控的下游靶点在HPC保护心肌细胞的过程中发挥作用。四、结论本课题首次在IHAH预处理抗心肌I/R的动物及细胞模型上观察锌指核转录因子ZFP580的作用，并证实ZFP580可能作为ERK1/2信号途径的下游靶点之一在IHAH抗心肌I/R损伤中发挥抗心肌细胞凋亡的作用。
【作者】孟祥艳；
【导师】刘洪涛；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，劳动卫生与环境卫生学，2014，博士
【关键词】再灌注损伤；锌指；转录因子；缺氧；凋亡；

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