母婴分离应激致肠易激综合征的生物学特征及同型半胱氨酸损伤机制

【摘要】肠易激综合征(IBS)是一种以腹痛/腹部不适伴排便习惯改变为特征的常见的功能性肠病，其发作具有持续或反复的特点，缺乏形态学和生物化学改变的生物学标志，肠道运动紊乱和内脏感觉过敏被认为是其重要的病理生理改变。其发病率高，且发病以中青年为主，严重影响患者的生活质量。该病病因和发病机制复杂，流行病学调查显示，80%IBS患者中，应激可造成IBS症状发作或加重，有精神创伤史者IBS发病率明显高于健康人群，而长期的精神心理应激刺激将对IBS产生直接致病作用。本研究探讨应激诱导IBS发生发展的生物学基础及其损伤机制，为深刻认识IBS的病理生理机制、探索其临床诊断与有效防治措施提供靶点和科学依据。一、母婴分离应激致肠易激综合征的生物学特点新生期母婴分离（MS）是一种早期负性生活应激事件，可诱导出大鼠IBS主要病理特征即内脏痛觉过敏和应激时结肠运动加强。本研究选用SD新生大鼠，采用新生期母婴分离方法建立应激致肠易激综合征大鼠模型，母婴分离时间为PND（出生后天数）2-PND21，每天分离3h。按照功能性疾病诊断方法，以大鼠行为学（旷场试验和蔗糖水偏嗜度试验反映动物精神活动）、大便性状及排泄率（单位时间内的动物排便粒数反映其胃肠道转运功能）、结肠组织病理学和内脏敏感性（结直肠扩张—腹部回撤反应压力阈值反映动物内脏敏感性）等疾病诊断标准确认肠易激综合征疾病动物模型的建立。结果显示，与对照组相比，模型大鼠内脏疼痛压力阈值显著下降，内脏敏感性增强，急性应激后肠道转运加快；出现糖水消耗量下降、探究行为减少及排便数量显著增加等抑郁、焦虑样行为学改变；H-E染色可见结肠各段组织结构完整，未见病理学改变；大鼠未见生长迟滞，新生期及成年后体重增长未见异常，符合IBS临床表型特征，表明新生期母婴分离应激3h致IBS大鼠模型成功建立。对IBS大鼠生物学特点研究结果表明，新生期母婴分离应激致大鼠IBS样症状存在性别差异，表现为雌鼠较雄鼠肠道敏感性增高更明显，这与临床女性发病率高于男性相似；分离3h和分离4.5h的不同应激时间对IBS大鼠症状严重程度未造成明显影响；单纯分离和分离附加孤养的不同应激类型对IBS大鼠症状严重程度亦未造成明显影响。二、母婴分离应激致肠易激综合征的生物学基础的探索本研究选取母婴分离应激3h建立IBS大鼠模型，鉴于雌性动物涉及较多的变量因素且多不可控如激素周期的影响，选取雄性大鼠开展下列研究：1.母婴分离应激致肠易激综合征的神经内分泌基础采用ELISA方法分别检测大鼠血浆GC、NE、Ach、5-HT、CGRP、SP和GAS浓度。结果显示，母婴分离应激致IBS发病过程中引起HPA轴和自主神经系统异常活化，模型大鼠血浆CORT和Ach浓度较对照组显著升高；血浆SP、GAS和5-HT水平轻度升高，CGRP浓度显著升高。急性束缚应激2h后，上述指标均呈现持续而显著升高。提示神经内分泌紊乱可能是应激致IBS的生物学基础。母婴分离大鼠成年后上述神经内分泌激素持续高水平，表明早期生活事件引起神经内分泌长期异常，导致对应激反应的易感性。2.母婴分离应激致肠易激综合征的炎症机制采用ELISA方法分别检测大鼠血浆炎性因子TNF-α和NO水平，可见模型大鼠血浆TNF-α水平较对照组显著升高，急性束缚应激后进一步增加，且与对照应激组有显著差异；而血浆NO含量明显降低，急性应激后进一步下降；甲苯胺蓝病理染色观察可见结肠肥大细胞活化，结肠黏膜肥大细胞数目和脱颗粒比例较对照组增加，表明母婴分离应激致IBS发病过程中存在炎症反应。3.母婴分离应激致肠易激综合征的代谢机制采用代谢组学技术分析母婴分离应激致IBS大鼠血清内源性代谢产物，定性分析发现早期应激造成机体氨基酸、糖类及脂类共45种代谢产物发生异常改变，其中7种代谢分子包括丝氨酸、甘氨酸及缬氨酸等在母婴分离组明显增高，上述氨基酸参与肠道内多种生物活性物质的合成与调节，对维持肠黏膜完整性和肠道功能意义重大，表明母婴分离应激致IBS发病过程中机体形成肠易激综合征易感的代谢模式。采用HPLC方法检测血浆中Hcy水平，发现模型大鼠血浆Hcy水平显著升高，急性应激后进一步升高，出现Hcy代谢异常，但早期应激与成年后急性应激的叠加效应不明显。代谢组学结果显示，模型大鼠血浆丝氨酸含量显著升高，丝氨酸是Hcy转硫代谢的关键底物，Westernblot显示结肠组织Hcy转硫代谢酶胱硫醚β-合成酶(CBS)表达水平下降，表明在母婴分离应激致IBS进程中Hcy转硫代谢受到抑制，导致Hcy代谢异常。应激所致氨基酸等代谢模式异常可能是母婴分离应激致IBS发病的分子基础。Hcy作为前炎症因子和免疫调节分子，其代谢异常可能启动或介导了母婴分离应激所致IBS的病理过程。三、Hcy在母婴分离应激致肠易激综合征发病中的损伤机制1.Hcy是母婴分离应激致IBS发生的重要介导因子为了观察Hcy在母婴分离应激致IBS发生中的作用，本实验采用外源性补充Hcy代谢辅酶复合物（叶酸、维生素B6、维生素B12和甜菜碱复合水溶液）调节机体Hcy水平，将IBS模型大鼠随机分为两组，一组给予Hcy代谢辅酶（MS+VitB），一组给予水（MS），灌胃体积2ml，连续7天；对照组为不接受分离应激大鼠，给予水灌胃。结果发现，补充Hcy代谢辅酶组大鼠血浆Hcy水平较模型大鼠显著降低，下降了30%，但仍略高于对照组Hcy水平。伴随血浆Hcy水平的降低，IBS大鼠肠道内脏高敏和转运增强症状明显改善，同时血浆炎性因子TNF-α水平随之降低，进一步确认Hcy介导了母婴分离应激致IBS的发生。2.Hcy对母婴分离应激致IBS大鼠肠道屏障功能的调控为了探讨Hcy介导母婴分离应激致IBS的生物学机制，首先，通过三糖试验观察Hcy对肠道通透性的影响。采用超高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定尿液中不同时间段内甘露醇、乳果糖和三氯蔗糖三种糖分子探针含量，发现灌服三糖分子水溶液后0-5h，各组大鼠尿液中甘露醇排泄量未见差别，模型大鼠乳果糖排泄量较对照组显著增加，乳果糖/甘露醇比值显著增高，补充Hcy代谢辅酶后明显下降；6-24h模型大鼠尿液中三氯蔗糖排泄量亦较对照组显著增加，给予维生素后明显降低，表明母婴分离应激致IBS进程中肠道细胞旁通透性增高，肠道上皮机械屏障功能受损，调节Hcy水平后此损伤效应明显减轻。采用透射电镜观察Hcy对结肠上皮紧密连接结构完整性的影响，发现模型大鼠结肠上皮紧密连接结构破坏，与对照组相比，紧密连接疏松、间隙增宽、密度降低，调节Hcy水平后，结肠上皮细胞紧密连接结构的完整性得以恢复。采用Westernblot和免疫荧光方法观察Hcy对结肠上皮紧密连接蛋白occludin表达及分布的影响，发现模型大鼠结肠上皮紧密连接蛋白occludin表达水平较对照组显著减少，补充Hcy代谢辅酶后表达量的降低有所减缓；模型大鼠结肠黏膜上皮occludin分布发生改变，阳性染色变淡，分布不连续，调节Hcy水平后上述改变有所缓解，提示母婴分离应激致IBS进程中，结肠紧密连接受到破坏，导致结肠旁细胞通透性增加，出现上皮屏障功能障碍，调控Hcy水平对母婴分离应激诱导的IBS模型大鼠肠黏膜屏障损伤具有一定的修复作用。表明Hcy可能是通过损伤肠道紧密连接屏障进而介导了IBS的病理过程，而occludin可能是Hcy介导IBS的分子基础。3.Hcy破坏紧密连接蛋白的作用机制为了进一步研究Hcy对肠黏膜机械屏障功能的损伤机制，本实验采用Caco-2细胞建立体外结肠上皮细胞紧密连接模型，给予低浓度Hcy（不造成细胞凋亡的浓度）与TNF-α单独或联合干预24h，采用Westernblot和细胞免疫荧光技术观察紧密连接蛋白occludin表达和分布变化，结果显示，Hcy干预引起occludin表达减少，occludin蛋白由细胞膜顶端向细胞内转移，出现分布异常。提示Hcy可直接破坏细胞间紧密连接结构的完整性，引起细胞旁通路开放，造成肠道通透性增高，从而诱发炎症反应。即Hcy单独启动了肠道上皮紧密连接的破坏，而不需要TNF-α的介导作用。综上所述，新生期母婴分离3h应激可导致IBS发生，发病特点具有性别差异，表现为与雄性大鼠相比，雌性大鼠对应激更易感。应激所致神经、内分泌、免疫炎症及代谢调控网络紊乱造成肠道黏膜损伤和防御机制失衡，肠道屏障功能下降，是母婴分离应激致IBS易感的病理生理基础。Hcy代谢异常是母婴分离应激致IBS的重要介导因子，其可通过改变肠道上皮细胞紧密连接蛋白occludin水平和分布，引起肠道上皮细胞旁通透性增高，肠道上皮机械屏障功能受损，诱导炎症反应，使肠道处于低度炎性环境，造成肠道感觉和运动功能异常，从而导致成年后IBS易感性增强，控制应激机体Hcy水平可有效降低IBS发生率。
【作者】赵云；
【导师】钱令嘉；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】母婴分离应激；肠易激综合征；同型半胱氨酸；紧密连接蛋白；肠道通透性；

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