重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响

重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-18 分类:论文格式 喜欢:3522
师大云端图书馆

【摘要】胶质瘤是人类最常见的颅脑肿瘤,传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗,治疗效果有限。研究发现脑肿瘤干细胞(braintumorstemcell,BTSC)的存在是胶质瘤复发、转移的主要原因,以BTSC为治疗靶细胞,尤其是诱导BTSC的分化治疗为胶质瘤治疗提供了新途径。白介素-24(Interleukin-24,IL-24)是近年发现的、具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因,具有抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡的广谱抗肿瘤活性。最近研究发现IL-24在造血系统恶性肿瘤中能够诱导肿瘤细胞向成熟单核-巨噬系分化。IL-24对肿瘤干细胞的增殖和分化的影响尚未见报道。因此,本课题拟研究IL-24对BTSC增殖和分化的作用,本研究分以下三部分阐述:第一部分IL-24表达质粒的构建及重组蛋白的表达、纯化目的:构建白介素-24(Interleukin-24,IL-24)的原核表达质粒pET28a-IL24,利用其转化BL21(DE3)菌株,表达重组蛋白IL-24,通过鉴定、纯化、复性获得重组蛋白IL-24。方法:利用分子生物学技术,将IL-24的cDNA插入到表达质粒pET28a(+),通过酶切、测序鉴定重组载体。鉴定正确重组质粒转化菌株BL21(DE3)进行蛋白表达,SDS-PAGE电泳和WesternBlotting鉴定,确定目的蛋白的表达。通过重组工程菌的诱导培养,获得重组蛋白IL-24包涵体。洗涤后利用目的蛋白携带的6×His纯化标签,采用镍离子亲合层析纯化蛋白IL-24。通过透析复性使目的蛋白正确折叠。结果:成功构建IL-24表达质粒pET28a-IL24,DNA测序结果显示,IL-24序列与Genebank(NCBIReferenceSequence:NG029565.1)序列完全吻合。重组表达质粒pET28a-IL24转化表达菌株后,经诱导培养,收获菌体总蛋白经SDS-PAGE电泳并考马斯亮蓝染色后,分析表达目的蛋白IL-24约占菌体总蛋白的36.47%,且目的蛋白的表达形式主要为包涵体。洗涤溶解后采用镍离子亲合层析得到纯度为90%以上的重组人IL-24(RecombinantHumanInterleukin-24,rhIL-24)。复性的rhIL-24蛋白冷冻抽干后-20℃保存。结论:成功构建IL-24的原核表达质粒pET28a-IL24,在大肠杆菌高效表达重组蛋白IL-24,采用镍离子亲合层析法获得rhIL-24,为下一步实验奠定基础。第二部分胶质瘤细胞U251中脑肿瘤干细胞的分选、鉴定目的:采用无血清悬浮培养和免疫磁珠分选相结合的方法进行人脑胶质瘤U251细胞系中脑肿瘤干细胞(braintumorstemcell,BTSC)的分选,并鉴定。方法:首先将U251细胞接种于含有生长因子的无血清培养基,通过悬浮培养法得到含有大量BTSC的脑肿瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球上的表达。分离脑肿瘤干细胞球中的BTSC,运用CD133标记的免疫磁珠对BTSC进行分选和纯化,并用流式细胞仪检测分选后BTSC的CD133表达阳性率。通过MTT法和细胞单克隆形成率实验检测分选的CD133+的BTSC的增殖活性。结果:U251细胞在含血清的培养液中呈贴壁生长,增殖活跃。U251细胞接种于无血清培养基后,24至48小时内大部分细胞贴壁,一部分细胞呈单细胞悬浮状态;并有一部分细胞发生非特异聚集。培养72小时后开始形成细胞球,悬浮于培养基中,随后细胞球逐渐增大,形成典型的脑肿瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测显示CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球上的高表达。利用免疫磁珠分选技术纯化CD133+细胞,流式细胞仪检测脑肿瘤干细胞球中的细胞经分选后,CD133+细胞比例达到95.8%。MTT检测发现CD133+细胞的增殖能力显著强于CD133-细胞;同时CD133+细胞单克隆形成率高,而CD133-细胞几乎不能形成典型的脑肿瘤干细胞球。结论:U251经含有生长因子的无血清培养液悬浮培养后,能够形成典型的脑肿瘤干细胞球,且CD133+细胞比例显著增高。利用免疫磁珠分选技术从脑肿瘤干细胞球中分选获得高纯度的CD133+细胞,且其增殖能力强。第三部分rhIL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响目的:研究rhIL-24对CD133+的BTSC的增殖和分化的影响。方法:通过MTT实验检测CD133+BTSC在经rhIL-24治疗后细胞的增殖活性;通过细胞形态学观察及细胞免疫荧光检测NeuN和GFAP的表达研究rhIL-24对CD133+BTSC分化的影响;流式细胞分析研究rhIL-24对CD133+BTSC中CD133表达的影响;裸鼠移植瘤成瘤实验,观察rhIL-24治疗后的CD133+BTSC成瘤能力。结果:MTT实验显示rhIL-24能够显著抑制CD133+BTSC的增殖。经rhIL-24诱导培养的CD133+BTSC在含生长因子的无血清培养液中培养7天后,细胞形态多样,突起增多变长;神经元标记物NeuN和星形细胞标记物GFAP的表达显著增高,而BTSC标记物CD133的表达明显降低,但没有完全消失,说明BTSC分化不彻底,细胞不能达到终末分化。在裸鼠移植瘤成瘤实验中,经rhIL-24诱导培养的CD133+BTSC在裸鼠中的成瘤能力显著降低。结论:rhIL-24能够抑制CD133+BTSC的增殖,降低BTSC中CD133的表达,细胞进入分化,成瘤能力显著下降。说明IL-24对脑肿瘤干细胞的增殖和分化起着重要作用,为IL-24治疗脑胶质瘤提供新思路和方法。
【作者】王云;
【导师】刘春风;
【作者基本信息】苏州大学,神经病学(专业学位),2013,博士
【关键词】胶质瘤;肿瘤干细胞;IL-24;增殖;分化;

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