PDX-1、NeuroD1及MafA转导小鼠骨髓间充质干细胞及小鼠iPS细胞制备胰岛素分泌细胞的实验研究

【摘要】目的观察胰岛素转录关键调控基因PDX-1、NeuroD1及MafA转染小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)和小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)后，能否定向分化为胰岛素分泌细胞，探索体外基因转染制备胰岛素分泌细胞用于移植治疗1型糖尿病的可行性。方法(1)全基因合成小鼠PDX-1、NeuroD1及MafA基因（以下简称三基因）编码区域序列并测序。将目的基因片段分别与内部核糖体进入位点序列-绿色荧光蛋白（IRES-GFP）进行PCR拼接，得到目的基因与GFP的共表达片断，并将含目的基因序列的质粒重组到腺病毒载体上。分别将含目的基因PDX-1、NeuroD1及MafA的腺病毒载体转染293A细胞，制备重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP，通过免疫法检测腺病毒液滴度。(2)体外分离培养及鉴定mBMSCs；小鼠Oct4、Sox2、Klf4及cMyc经Tet-On慢病毒系统转导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），挑选并扩增克隆。通过形态学鉴定，干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1检测，体内外三胚层分化等实验筛选鉴定iPSCs。(3)重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP体外联合转染mBMSCs及小鼠iPSCs。转染获得的细胞分别用RT-PCR检测胰岛β细胞功能基因的表达；免疫荧光检测胰岛素蛋白的表达及定位；ELISA检测不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。(4)三基因转染的mBMSCs及小鼠iPSCs定向分化为胰岛素分泌细胞后，移植到糖尿病小鼠模型肝脏，免疫组化检测其在肝内胰岛素的表达；空腹血糖监测检测移植细胞在糖尿病小鼠体内的功能发挥。结果(1)重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP经PacI单酶切后凝胶电泳显示会形成约2,000bp的小条带及腺病毒载体将近35,000bp的大条带，与预期及测序结果一致，表明含三基因的同源重组腺病毒载体构建正确。(2)LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc转染MEFs后，成功获取iPSCs，能形成边缘光整的致密克隆；表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1；在体内外能分化为三胚层组织。(3)Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP体外联合转染的mBMSCs及小鼠iPSCs能分化为胰岛素分泌细胞，RT-PCR结果显示其胰岛β细胞功能基因的表达与小鼠胰岛β细胞株MIN6类似；免疫荧光检测见细胞胞浆内有胰岛素合成；ELISA检测结果显示细胞对不同浓度的葡萄糖有较好的反应性。(4)免疫组化镜检发现移植细胞注射区域的肝实质内可见相对集中的棕黄色细胞，表明移植细胞胞浆内表达胰岛素蛋白；空腹血糖监测显示移植细胞能够控制糖尿病小鼠的高血糖，在体内发挥良好的治疗作用。结论(1)LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc能成功将MEFs重编程为iPS细胞。(2)胰岛素转录关键调控基因PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用，促进mBMSCs及小鼠iPSCs定向分化为具有显著的胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。(3)胰岛素转录关键调控基因修饰的mBMSCs及小鼠iPSCs移植体内能发挥一定的治疗作用，有希望成为胰岛β细胞的替代细胞用于移植治疗1型糖尿病。
【作者】范向军；
【导师】钱海鑫；
【作者基本信息】苏州大学，外科学（专业学位），2013，博士
【关键词】胰岛素；转录因子；β细胞；mBMSCs；小鼠iPSCs；

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