莱芜猪和大白猪背最长肌miRNA与mRNA转录组测序及特征分析

【摘要】猪不但可以作为重要的农业经济动物为人类提供大量的肉类产品，而且还可以作为模式生物用于医学研究。由于遗传背景及人工选育方式的不同，造成了中外猪种在生产性状方面存在很大的差异。比如，莱芜猪作为我国特有的猪种资源，具有肉质优良的种质特性；而西方猪种虽然在生长速度方面具有优势，但是其较差的肉品质已不满足于消费者的需求。大量研究证实中外猪种间种质差异的形成与基因的差异表达有关，因此，从转录组水平探索中外猪种骨骼肌差异表达基因，对于解析品种间的差异及揭示形成该差异的分子机理具有重要作用。本研究选用生长速度慢但肉质优良的莱芜猪（Laiwupig,LW）和生长速度快但肉质较差的大白猪（Yorkshire,YS）作为试验动物，利用高通量测序技术分析了莱芜猪与大白猪骨骼肌中的差异表达miRNA与差异表达基因，并对差异表达miRNA与基因进行筛选及信号通路富集，分析差异miRNA与差异基因在中外猪种中的功能。对于差异表达miRNA，采用生物信息学软件预测了这些miRNA可能的靶基因，构建了差异表达miRNA的调控网络图。为了验证高通量测序结果的正确性，我们采用qRT-PCR方法对差异表达miRNA与差异基因进行了定量验证，结果表明，高通量测序结果比较可靠。本研究的主要结果如下：（1）莱芜猪与大白猪骨骼肌小RNA测序分析分别构建了3个莱芜猪与3个大白猪的背最长肌小RNA文库，并利用RNA-seq技术对6个小RNA文库进行了测序，分析miRNA在莱芜猪与大白猪中的表达模式。结果表明，平均在每个莱芜猪的小RNA文库中获得了13,493,607的纯净测序reads，大白猪约为12,938,257。总共筛选出265个已知miRNA，其中有229个在6个文库中都表达；另外，还预测到94个新miRNA。对筛选出的359个miRNA进行表达分析，结果发现ssc-miR-1在两个品种猪中都是表达量最高的，而ssc-miR-194b-5p在两个品种猪中的差异倍数最大（6.35倍）；此外，还发现有25个miRNA在莱芜猪与大白猪骨骼肌中是显著差异表达（q<0.05）。在25个差异显著的miRNA中，有10个miRNA在莱芜猪中上调表达，15个下调表达。为了验证测序结果的准确性，随机选取了16个miRNA进行qRT-PCR验证，qRT-PCR结果与测序结果基本一致。对差异表达miRNA的靶基因进行预测，结果获得了10,806个靶基因，而这些靶基因主要被富集到代谢过程等信号通路中。（2）莱芜猪与大白猪骨骼肌mRNA转录组测序分析为了研究莱芜猪与大白猪骨骼肌全基因组的转录谱，利用RNA-seq技术对构建的两个品种猪骨骼肌文库进行测序，测序结果显示在莱芜猪的文库中获得了40,498,476的测序reads，大白猪为59,072,892；其中，80%以上的测序reads可以比对到猪的基因组中。在两个文库中共检测到12种选择性剪切类型分析，其中以TSS（转录起始位点）与TTS（转录终止位点）两种剪切类型所占的比例最大，分别占到43%和40%以上。通过对测序reads进行比对分析，结果显示在莱芜猪与大白猪骨骼肌中有10,482个共表达基因，另有739个基因只在莱芜猪中表达，712个基因只在大白猪中表达。在两个品种猪中总共预测得到1,678个新基因，其中对应2,229个新转录本。为了更进一步研究这些差异基因的功能，对这些差异基因进行检验分析，结果表明在莱芜猪与大白猪骨骼肌中有178个显著差异表达的基因（q<0.05），其中，相对于大白猪，在莱芜猪中有98个差异基因为上调表达，80个下调表达。为了验证这些差异基因的正确性，随机选取了12个差异表达基因进行qRT-PCR验证，测序结果与qRT-PCR结果基本一致，两者具有很强的相关性（R2=0.93）。对差异表达基因进行功能注释，发现差异表达基因主要被富集到代谢通路，尤其是与脂肪代谢相关的信号通路，比如脂肪酸合成代谢通路等。（3）骨骼肌差异miRNA与差异基因关联分析为了从整个转录水平了解两个品种猪差异表达miRNA及差异基因的功能，对178个差异表达基因与25个差异表达miRNA进行关联分析，结果表明只有10个miRNA在关联分析中达到显著水平（q<0.05），上调表达4个、下调表达6个。关联分析结果表明，6个下调miRNA对20个上调差异表达基因具有调控作用；4个上调miRNA对20个下调表达差异基因具有调控作用。综上所述，本研究从miRNA和mRNA两个水平系统研究了两个品种猪骨骼肌差异表达基因，并对这些差异表达基因进行了功能注释、通路分析及互作网络调控分析等；并采用qRT-PCR方法验证了部分差异基因的表达水平。为研究不同表型猪的比较转录组学提供了宝贵的遗传资源与材料，并且有助于提高对猪转录组遗传结构的认识和理解。
【作者】陈伟；
【导师】曾勇庆；
【作者基本信息】山东农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】猪；背最长肌；mRNA；microRNA；RNA-seq；差异表达基因；

【参考文献】
[1]党小庆.大型电除尘器和袋式除尘器气流分布数值模拟与应用研究[D].西安建筑科技大学,2008.
[2]姜宇.百年中学生物教科书中细胞学内容的变迁研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[3]王帅伟.大口径不锈钢无缝钢管斜轧穿孔裂纹缺陷的研究[D].燕山大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[4]王雪.景德镇大师瓷品牌发展构想[D].南昌大学,新闻与传播学（专业学位）,2014,硕士.
[5]葛一凡.不同铝合金材料及薄壁铝合金管超声TIG复合焊工艺性能研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[6]牛力.冻结和冻藏对鸡胸肉食用品质的影响[D].南京农业大学,食品科学,2012,硕士.
[7]王庆元.慢性心力衰竭患者内皮依赖性血管舒张功能的变化及阿魏酸钠对其影响[D].青岛大学,内科学,2004,硕士.
[8]罗东向.新型金属氧化物薄膜晶体管的性能研究及工艺开发[D].华南理工大学,2014.
[9]杨正武.瘦素、胰岛素抵抗与非酒精性脂肪性肝病关系的临床研究[D].青岛大学,内科学,2004,硕士.
[10]苏照环.海洋生境分泌α-淀粉酶抑制剂微生物的筛选及活性成分纯化的研究[D].广西师范大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[11]张平贵.成都市农民工住房保障问题研究[D].西南交通大学,社会保障,2013,硕士.
[12]杨帆.基于FPGA的服务器工作状态模拟测试系统设计[D].湖南师范大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[13]周文文.中国电信绍兴分公司竟争战略的研究[D].浙江大学,2001.
[14]刘娜.城市土地供应与房价的关系[D].重庆大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[15]楚向锋.柴油机SCR后处理中尿素沉积物的机理研究[D].上海工程技术大学,车辆工程,2014,硕士.
[16]李金源.精神科急重症病区护士工作压力感受的研究[D].山西医科大学,护理学（专业学位）,2013,硕士.
[17]梅红.数据挖掘技术在图书馆信息咨询系统中的应用[J].江西教育学院学报(综合),2005,03:35-36.
[18]王丽.人参中强心活性部位的筛选[D].吉林农业大学,生药学,2012,硕士.
[19]布伦.Complications Following the Management of Open Comminuted Mandibular Fractures with Open Reduction and Stable Internal Fixation[D].华中科技大学,口腔医学,2013,硕士.
[20]王晓宇.红外图像分析关键技术研究[D].华中科技大学,2008.
[21]王静,孙彦广,王朝玉.基于JaguarCTS的中间件技术在企业信息管理系统中的应用[J].冶金自动化,2003,02:44-46+55.
[22]沈鸿.宁波万华工业园循环经济评价研究[D].浙江工业大学,2013.
[23]刘育良.论行政强制中的比例原则[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[24]罗茜文.汉语语病研究百年史[D].四川外国语大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[25]刘芳.口腔卫生指导对2型糖尿病伴慢性牙周炎患者的影响[D].南方医科大学,口腔临床医学,2012,硕士.
[26]刘海哲.基于LabVIEW的两轮自平衡车的机电系统建模与仿真[D].沈阳建筑大学,机械电子工程,2012,硕士.
[27]贠惠娜.基于三角模糊数-TOPSIS法的高速公路穿越高铁施工方案比选研究[D].西安建筑科技大学,土木工程建造与管理,2013,硕士.
[28]汪家铭.计算机网络化的机器在线监测技术[J].冶金自动化,1994,04:30-33.
[29]苏苌.甘肃甘南玛曲沼泽化草甸土壤纤毛虫群落对不同放牧强度的响应[D].西北师范大学,生态学,2013,硕士.
[30]邱丽敏.汽油中甲基苯胺检测方法的研究[D].华南理工大学,化学工程,2012,硕士.
[31]田明珍.沈德潜视野中的唐诗典范[D].华中师范大学,中国古代文学,2014,硕士.
[32]黄建.大学生篮球运动员球商构成诸因素分析[D].湖南师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[33]彭寒梅,曹一家,黄小庆,杨宵,刘玲.基于时变通用生成函数的孤岛运行模式下微电网可靠性评估[J].电力系统自动化,2015,10:28-35.
[34]孙凯.微博用户情感体验、需求满足与用户满意关系的研究[D].山东财经大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[35]张蕾.民族艺术生态发展规律探讨[D].广西民族大学,美学,2013,硕士.
[36]陈重威.“玩”出来的诺贝尔奖[J].今日中学生,2011,Z1:53-57.
[37]任俏.约翰迪尔天拖公司ERP系统应用绩效评价研究[D].北京交通大学,工业工程（专业学位）,2013,硕士.
[38]徐菁.从二语习得理论角度看如何为中国读者设计优秀英语儿童读物[D].上海外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[39]王媛媛.微博空间中虚拟自我的伦理失范及其治理研究[D].信阳师范学院,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[40]于潇.基于脉搏波速度的无创连续血压测量系统研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[41]虞琛.论《紫颜色》的叙事形式与特征[D].湖南师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[42]吴正栋.船舶所有权变动模式研究[D].大连海事大学,海商法,2014,硕士.
[43]于燕玲.我国禁婚疾病制度的反思与重构[D].烟台大学,法律,2014,硕士.
[44]冯晓明.中行甘肃省分行行政事业机构客户CRM改进研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[45]魏萌.焦化污染场地土壤中PAHs的赋存特征及热脱附处置研究[D].首都师范大学,环境工程,2013,硕士.
[46]热孜亚·艾肯.塔里木河胡杨内生细菌的多样性分析及一株潜在新种的多相分类学鉴定[D].新疆大学,生物学,2013,硕士.
[47]上官兴贺.ATP-TCA法在晚期肺腺癌二线化疗中的临床研究[D].吉林大学,内科学,2013,硕士.
[48]王旭.基于FPGA的温度传感报警系统设计[D].北京交通大学,2014.
[49]王舟.环氧树脂/氧化石墨烯纳米复合材料的制备和表征[D].北京化工大学,2010.
[50]张婧思侯玲玲*胡红刚晏琼.间充质干细胞抑制肿瘤细胞增殖机制的研究进展[J].中国细胞生物学学报.