新型喹唑啉衍生物WYK431的抗肿瘤作用及机制研究
【摘要】胃癌(GC)是严重危害人类健康的常见肿瘤之一,在全球癌症死亡率仅次于肺癌居第二位,胃癌发病率存在明显的地域差异,在部分亚洲国家、欧洲中部、美国中部和南非发病率较高,尤其是日本、韩国和中国东亚三国为高发地区,其发病总数约占全球总数的2/3。在中国胃癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位。在我国每年有近30万人死于胃癌,另有约40万新发病例。传统治疗例如手术治疗、放疗、化疗在胃癌的早期阶段发挥重要作用,晚期胃癌病人主要采用联合治疗的方式,但是晚期胃癌病人总的生存期仍不尽如人意。更好了解胃癌发生机制,采用新的治疗手段对晚期胃癌来说是非常必要的。目前研究表明,胃癌组织和细胞很多基因发生了突变,例如：HER-2过表达、EGFR过表达、PIK3CA突变和PTEN缺失。HER-2在10%-38%胃癌样本中高表达；EGFR在27%-44%胃癌样本中高表达。这两个受体被激活以后形成同源或异源二聚体,然后激活PI3K-Akt-mTOR信号通路和Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。PI3K-Akt-mTOR信号通路在胃癌中经常被激活,PIK3CA在4%-36%的胃癌病例中发生了激活突变,PTEN在20%-36%胃癌病例中发生了缺失。由于上游受体的过表达、PIK3CA激活突变和PTEN缺失,导致29%-86%胃癌病人持续激活p-Akt和47%-64%胃癌病人持续激活p-mTOR。Ras-Raf-MEK-ERK信号通路是HER家族下游的一条重要的信号通路。在胃癌中K-RAS在2%-20%胃癌病例中发生了突变,B-RAF在0%-2.7%胃癌病例中发生了突变。这两个信号通路在细胞的增殖和存活中发挥重要作用。关于晚期胃癌的靶向治疗也主要集中在HER信号通路、PI3K-Akt-mTOR信号通路和Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。曲妥珠单抗己被批准用于HER-2+晚期胃癌的一线治疗。西妥昔单抗、帕尼单抗、拉帕替尼和依维莫司处于临床Ⅲ期阶段。WYK431是新型喹唑啉衍生物,前期研究表明,其对多种肿瘤细胞株均有较好的生长抑制作用。其中对人胃癌BGC823细胞最敏感,48hIC50为2.16μM,但机制不明。本研究,我们评价了WYK431对人胃癌BGC823细胞体内抗肿瘤活性,并对其作用机制进一步研究。皮下异体移植胃癌BGC823细胞的BALB/c裸鼠分别给予5mg/kg、10mg/kg和20mg/kgWYK431治疗。结果显示5mg/kg、10mg/kg和20mg/kgWYK431治疗组与对照组相比抑瘤率分别为28.4%、41.9%和63.6%(p<0.05)。WYK431治疗组耐受性良好,体重只有轻微的降低。血液学分析结果显示,WYK431没有显著降低白细胞数量。周期分析结果表明,WYK431能够将BGC823细胞阻滞于G2/M期。DAPI染色结果显示,WYK431可以明显诱导人胃癌BGC823细胞呈现明显的凋亡形态学特征：细胞容积变小,染色质固缩,并产生核碎片和凋亡小体。AnnexinV-FITC/PI双染进一步表明,WYK431诱导BGC823细胞凋亡并呈剂量依赖性增多。TUNEL分析结果显示,与对照组相比,WYK431治疗组TUNEL阳性细胞数量明显增加。这一结果提示WYK431诱导了肿瘤组织内细胞凋亡。为了进一步探讨WYK431引起胃癌BGC823细胞凋亡的机制,我们采用Westernblotting法对细胞中凋亡相关蛋白caspase-3,caspase-8和caspase-9进行了检测。结果表明,WYK431可以激活caspase3和caspase9,这一实验结果显示WYK431通过线粒体途径诱导胃癌BGC823细胞凋亡。线粒体膜电位遭受破坏后,细胞色素C从线粒体释放到细胞质是线粒体凋亡途径重要一步。结果显示,WYK431可以通过改变线粒体的膜电位,细胞色素c从线粒体释放到细胞质。线粒体膜电位受Bcl-2家族蛋白调控,Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白(Bax)和抑凋亡蛋白(Bcl-2)。Westernblot结果显示：WYK431上调促凋亡蛋白Bax的表达,对Bcl-2表达没有影响。综上所述,WYK431通过线粒体途径诱导胃癌BGC823细胞凋亡。PI3K/Akt和MAPK信号通路在细胞的增殖、存活中发挥重要作用。这两条信号通路在胃癌中处于异常活化状态,所以这两条信号通路也是胃癌治疗的重要靶点。实验结果显示,WYK431可以显著降低磷酸化Akt和Erk的表达,而对Akt和Erk的表达没有影响。EGFR在细胞增殖、分化、发育和肿瘤发生过程中发挥重要作用。已有研究报道,作为PI3K/Akt和MAPK信号通路上游,EGFR在胃癌中处于失调状态并且在胃癌的发生和发展过程中发挥作用。我们的研究结果显示,WYK431剂量依赖性降低磷酸化EGFR的表达,对EGFR表达没有影响。综上所述,WYK431是一个新型喹唑啉类小分子化合物,体外可以诱导胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞和线粒体途径凋亡,体内可以抑制荷胃癌BGC823细胞裸鼠异体移植瘤的生长。其抑瘤的作用机制可能与WYK431阻断了PI3K/Akt和p42/44MAPK信号通路有关。WYK431作为一个潜在的有效的抗肿瘤药物值得进一步研究。黑色素瘤是最具有侵袭力的皮肤肿瘤,其发病率的增长速度超过了其它肿瘤。全世界大约每年有46,000人死于转移黑色素瘤。对黑色素瘤的治疗依赖于病理分期。早期病人主要采取手术切除,对于有高复发风险的病人,除采用手术治疗外,联合IFN-a作为辅助治疗。截止到2011年,美国FDA批准用于黑色素瘤晚期治疗的药物只有达卡巴嗪(dacarbazine)和高剂量的IL-2(HDIL-2)。但是达卡巴嗪在临床的反应率只有10-15%,生存期只有8个月。HDIL-2临床反应率也很低,并且伴随多器官毒性,只有一小部分精心选择的病人可以表现出长期的无病反应状态。最近研究结果显示,开发新型的抑制黑色素瘤发生中关键突变分子为靶点的靶向药物可以提高反应率。B-RAFV600E是黑色素瘤中最常见的一种突变形式,在黑色素瘤患者中大约占50%。维罗非尼(Vemurafenib)B-RAF抑制剂主要抑制由于B-RAFV600E突变引起的MAPK信号通路的活性。临床试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期结果显示,维罗非尼显著改善了病人总生存期(OS)和无恶化生存期(PFS)。易普利姆玛(Ipilimumab)靶向细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4),对转移性黑色素瘤患者有显著的生存期延长优势。易普利姆玛和维罗非尼是转移性黑色素瘤标准化护理治疗的一次革命。然而现在最大的挑战是,解决维罗非尼获得性临床耐药,提高易普利姆玛反应率。临床样本显示,B-RAF抑制剂的获得性耐药可分为MAPK信号通路依赖的和非MAPK信号通路依赖的耐药。MAPK信号通路依赖的耐药机制包括N-RAS基因二次突变、B-RAF基因截短和COT激酶活性增加、C-RAF的活化和MEK1获得性突变。非MAPK信号通路依赖的耐药机制包括PDGFRβ,IGF1R,AXL,ERBB4酪氨酸激酶的上调、PI3K/AKT/mTOR和STAT3信号通路的活化。B-RAF和MEK抑制剂的联合治疗对B-RAF治疗过病人或没有治疗过的病人有良好的疗效。易普利姆玛联合辅助治疗提高易普利姆玛反应率正在临床评价中。第一部分研究发现,WYK431对人胃癌BGC823细胞有较好的抗肿瘤活性但靶点不明。本研究,对WYK431进行激酶谱检测,结果显示WYK431在10μM对PI3Kinase(p110δ/p85α)抑制率为80.5%。MTT结果显示,WYK431对很多人源肿瘤细胞株具有良好的抗肿瘤活性,其中人黑色素瘤A375细胞是最敏感的。皮下接种黑色素瘤A375细胞异体移植瘤的BALB/c裸鼠分别给予5mg/kg,10mg/kg和20mg/kgWYK431(i.p.)治疗。结果显示5mg/kg,10mg/kg和20mg/kgWYK431治疗组与对照组相比抑瘤率分别为18.92%,51.18%,76.60%(p<0.05)。WYK431治疗组耐受性良好,体重只有轻微的降低。免疫组化Ki67染色结果显示,WYK431治疗组与对照组相比Ki67阳性细胞数明显降低,提示WYK431可抑制肿瘤组织中细胞的增殖。并对其作用机制进一步研究。周期分析结果表明,WYK431能够将人黑色素瘤A375阻滞于S期。AnnexinV-FITC/PI双染结果显示,WYK431诱导人黑色素瘤A375凋亡并呈剂量依赖性增多。TUNEL分析结果可见,与对照组相比,WYK431治疗组TUNEL阳性细胞数量明显增加,提示WYK431诱导了肿瘤组织内细胞凋亡。免疫组化CD31染色结果也表明,WYK431治疗组肿瘤内微血管密度明显降低,提示WYK431具抑制肿瘤内血管生成。进一步探讨WYK431引起人黑色素瘤A375凋亡的机制结果显示,WYK431可以激活caspase3和caspase9o线粒体膜电位检测结果显示,WYK431可以降低线粒体的膜电位。WYK431上调促凋亡蛋白BAX的表达,对Bcl-2表达没有影响。综上所述,WYK431通过线粒体途径诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡。PI3K/Akt和MAPK信号通路在黑色素瘤中处于异常活化状态,是黑色素瘤治疗的重要靶点。实验结果显示,WYK431可以显著降低磷酸化Akt和Erk的表达,对Akt和Erk的表达没有影响。据文献报道,Stat3在大多数黑色素瘤细胞株和黑色素瘤临床样本中处于持续激活状态,Stat3信号通路激活与vemurafenib获得性耐药有关。我们的研究发现,WYK431剂量依赖性降低磷酸化Stat3的表达,对Stat3表达没有影响。综上所述,WYK431是一个新型的小分子化合物,体外可以诱导黑色素瘤A375细胞S期阻滞和线粒体途径凋亡。体内可以抑制黑色素瘤A375细胞皮下裸鼠异体移植瘤的生长。WYK431作为一个潜在的有效的抗黑色素瘤药物值得进一步研究。
【作者】王田恩；
【导师】陈晓光；
【作者基本信息】北京协和医学院，药理学，2014，博士
【关键词】WYK431；BGC823；线粒体凋亡信号通路；A375；血管生成；
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