重金属对斑马鱼的毒性效应及作用机制研究

【摘要】全球的污染物排放增加,带来了巨大的健康和环境问题。重金属如镉(Cd)、铅(Pb)、铜(Cu)、铬(Cr),具有高毒性,是重要的环境污染物,通过工业废水、城市和矿业资源等排放到环境中,到达水生环境,在水生生物体内积累,经由食物链对人类造成危害。斑马鱼是一种对环境污染物较为敏感的模式生物,已被广泛应用于胚胎发育毒理学、环境毒理学、病理毒理学、药物毒理学等多个领域,并展现出其特有的优势。本研究旨在全面评价重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼的毒性效应,了解重金属毒性作用的特点、性质、程度及毒性作用机制,明确重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼抗氧化防御系统,细胞凋亡及免疫系统的毒性作用及其机制,为阐明重金属毒性作用和重金属污染的环境风险评估提供依据。主要研究内容包括：重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼抗氧化能力指数的影响、重金属镉(Cd)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究、重金属铅(Pb)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究、重金属铜(Cu)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究、重金属铬(Cr)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究。主要研究结果如下：1)本研究以抗氧化能力指数(Oxygenradicalabsorbancecapacity,ORAC)检测方法为基础,建立一种机体清除自由基能力的检测方法,并应用于生物抗氧化能力的的评价。研究选用国际标准试验用鱼-斑马鱼作为试验生物,针对过氧自由基(ROO·)进行检测,以偶氮化合物AAPH作为氧自由基来源,荧光素钠(FL)为荧光指示剂,并以维生素E类似物Trolox为定量标准,观察自由基与荧光素钠作用后荧光强度的衰退过程,检测各种物质加入反应体系后延缓荧光素钠荧光强度衰退的能力,以此评价反应体系中抗氧化剂的抗氧化能力。本研究所建立的定量分析方法具有特异性强；精密度高,变异系数小于5%；准确度在97%-108%之间；重现性佳(变异系数是2.92%)；定量检出限和最低检测限分别为3.03和1.00μmolTrolox/mgprotein,可接受相关系数(R2)≥0.99。依据所建立的定量分析方法对斑马鱼ORAC生理正常值进行检测,正常值范围为0-50μmolTrolox/mgprotein,并根据重金属对斑马鱼ORAC的影响,对重金属的污染程度和毒性效应进行了评级和分类,提高了试验数据互认程度,推动了抗氧化防御系统生物标志物在环境污染监测中的应用。2)重金属镉(Cd)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究结果表明：重金属Cd对斑马鱼成鱼和胚胎的96h-LCso分别为24.341mg/L和46.67mg/L,胚胎孵化抑制作用的96h-EC50为42.499mg/L。重金属Cd引起斑马鱼成鱼SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bc1-2mRNA表达水平下调,而p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因-α,IL-1β,INF-γ和IL-8mRNA表达水平均显著性升高；MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,ERK3和核转录因子AP-1亚家族c-junmRNA表达水平均上升。重金属Cd引起斑马鱼胚胎心率减慢,体长减小；ROS水平显著升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,CAT,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bc1-2和p53mRNA表达水平均上调；免疫系统相关基因TNF-a,IL-1β,INF-ymRNA表达水平均显著性升高；MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,ERK3,JNK1和核转录因子AP-1亚家族c-jun,c-fos以及NF-κB亚家族relAmRNA表达水平均升高。以上结果提示Cd对斑马鱼成鱼和胚胎均具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生,毒性作用机制与MAPKs信号转导通路相关。3)重金属铅(Pb)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究结果表明：重金属Pb对斑马鱼成鱼和胚胎的96h-LC50分别为0819mg/L口22.574mg/L,胚胎孵化抑制作用的96h-ECso为19.594mg/Lo重金属Pb引起斑马鱼成鱼SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bcl-2mRNA表达水平下调,而p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因TNF-a,IL-1β,INF-γ和IL-8mRNA表达水平均显著性升高：MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,JNK1和核转录因子AP-1亚家族c-jun,c-fos以及NF-κB亚家族nfkb2mRNA表达水平均上升。重金属Pb引起斑马鱼胚胎心率减慢,体长减小；ROS水平显著升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,CAT,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bc1-2和p53mRNA表达水平均上调；免疫系统相关基因TNF-α,IL-1βINF-γmRNA表达水平均显著性升高；MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,ERK3,JNK1和核转录因子AP-1亚家族c-jun,c-fos以及NF-κB相关基因relAmRNA表达水平均上升。以上结果提示Pb对斑马鱼成鱼和胚胎均具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生,毒性作用机制与MAPKs信号转导通路相关。4)重金属铜(Cu)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究结果表明：重金属Cu对斑马鱼成鱼的96h-LC5o0为0.462mg/L;引起SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因TNF-a,IL-1β,INF-γ(?)IL-8mRNA表达水平均显著性升高。以上结果提示Cu对斑马鱼成鱼具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生。5)重金属铬(Cr)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究结果表明：重金属Cr对斑马鱼成鱼的96h-LC5o为113.808mg/L；引起SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因TNF-a,IL-1β,INF-γ和IL-8mRNA表达水平均显著性升高。以上结果提示Cr对斑马鱼成鱼具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生。本研究对传统的ORAC方法进行了一定程度上的改良,并将此法应用于环境污染监测和毒理学研究,研究了重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼抗氧化防御系统的影响,并全面评价了重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性效应及作用机制,发现氧化应激,细胞凋亡和免疫毒性之间存在着紧密的联系。
【作者】殷健；
【导师】王爱平；
【作者基本信息】北京协和医学院，药理学，2014，博士
【关键词】重金属；斑马鱼；抗氧化能力指数；氧化应激；免疫毒性；

【参考文献】
[1]欧光宇.基于能量利用率的电动公交客车动力系统控制方法研究[D].华南理工大学,车辆工程,2014,硕士.
[2]徐一娇.神经细胞mTOR通路抑制在实验性帕金森病发生中的作用及分子机理研究[D].南京师范大学,生物化学与分子生物学,2013,博士.
[3]乔景楠.水岸小镇物业经营管理项目可行性分析研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[4]俞国琴.辽宁杂草稻的遗传多样性及群体分化研究[D].浙江大学,作物栽培与耕作学,2004,硕士.
[5]王振北.水处理絮凝工艺强化及颗粒形态控制技术研究[D].哈尔滨工业大学,城市水资源,2013,硕士.
[6]吕丽娃.对萨满面具与现代材料相结合的探索[D].东北师范大学,艺术学,2012,硕士.
[7]先晓兵.基于WebService的外贸业务智能决策系统[J].微机发展,2005,04:51-53+101.
[8]MINHai-Bo,LIUZhi-Guo,LIUYuan,WANGShi-Cheng,YANGYan-Li.切换网络拓扑下Euler-Lagrange系统的分布式协调控制(英文)[J].自动化学报,2013,07:1003-1010.
[9]张艳晓.巨刺法结合颈部夹脊穴治疗中风后肩—手综合征Ⅰ期的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[10]赵镇南.近视眼视网膜OCT定量分析研究[D].复旦大学,眼科学,2012,硕士.
[11]刘斌.小型餐饮行业盈利模式影响因素研究[D].吉林大学,工商管理,2014,硕士.
[12]李铭.中国特色社会主义文化建设研究[D].南京师范大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2012,硕士.
[13]宋英启.我国慈善组织“行政化”及其改革问题研究[D].山东大学,行政管理,2013,硕士.
[14]刘娟.世界双遗黄山风景区文化遗产解读体系的建构[D].西北大学,考古学及博物馆学,2013,硕士.
[15]荣蓉.泸州临港物流园区适园量预测研究[D].北京交通大学,2014.
[16]赵耀,薛贵荣.WebService下的商品推荐系统的研究与实现[J].临沂师范学院学报,2003,06:131-134.
[17]王国权.铁路信号电缆对外来地电容不平衡的探讨[J].铁道通信信号.2008(07)
[18]袁伟.CSAMT一维正反演与场源效应研究[D].成都理工大学,固体地球物理学,2013,硕士.
[19]张利军.长距离多点监控系统的研究与应用[D].天津工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[20]陈珺.提高Darrieus型风力机风能利用率方法的数值研究[D].上海大学,流体力学,2014,硕士.
[21]陈兆宽,陈辉.正控制总量受限下离散线性系统的能控域[J].自动化学报,1994,06:718-722.
[22]陈建勋,欧阳院平,王明年.公路隧道复合式衬砌结构数值计算及分析[J].中国公路学报,2006,02:74-79.
[23]张超.社区物业管理公司的服务质量研究[D].华中科技大学,国际商务,2013,硕士.
[24]文艳琼.对外汉语词汇教学研究综论[D].华中科技大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[25]程行健.末端持续负压吸引救治静脉淤血皮瓣的微循环研究[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[26]薛惠敏,李克勇,薛洪,季本智.差分法计算深基坑支护结构[J].建筑技术.2003(02)
[27]杨星星.中学生科学创造力的动机研究[D].华东师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[28]张克.入世后提升吉林省农产品竞争力的分析与对策[D].吉林大学,企业管理,2004,硕士.
[29]袁丙强.三唑磷在室内淡水微宇宙中的生态效应研究[D].浙江大学,植物保护（专业学位）,2012,硕士.
[30]苗丕渠,王富花.壳聚糖在纳滤膜中的应用研究[J].广东化工,2015,04:148-149+135.
[31]魏德君.试论中国传统居室陈设的发展及当代居室陈设的特点[D].中央美术学院,设计艺术学,2004,硕士.
[32]韩西达.生物医用自动对焦显微成像分析仪的研制[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[33]郭睿.第三方支付法律规制研究[D].西南政法大学,经济法（专业学位）,2012,硕士.
[34]邓雅雯.工业遗产再利用视角下的广州创意产业园区规划开发研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[35]王锐.章太炎晚年学术思想研究[D].华中师范大学,专门史,2013,硕士.
[36]周翊.甘肃省农村信用联社信息化项目管理控制研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[37]韩斌.烷基取代苯硫酚类化合物的合成及制备工艺研究[D].天津理工大学,应用化学,2012,硕士.
[38]陈治邦.历史文化名村中民居建筑的空间形态比较研究及当代借鉴[D].北方工业大学,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[39]周俊波,向学建,时国松,董军.大型斜拉桥施工过程中吊架的优化分析[J].山西建筑,2015,17:146-148.
[40]陈柏文.足尺寸建筑模式下植被屋面的隔热性能及能耗特性研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[41]程云环.落叶松人工林细根生产和周转及其与土壤资源有效性关系[D].东北林业大学,2004.
[42]吴慧江.简述西周时期乐的功用[D].四川省社会科学院,专门史,2014,硕士.
[43]冯德明.基于PLC的花样喷泉控制系统的设计[J].中外企业家,2015,15:248.
[44]宋薇薇.原产地规则法律问题研究[D].中国政法大学,国际法,2004,硕士.
[45]赵诗奎.基于遗传算法的柔性资源调度优化方法研究[D].浙江大学,2013.
[46]李建军.日本企业管理的特点及其竞争力分析[D].东北财经大学,国际贸易学,2003,硕士.
[47]席广涛.初中生物课程资源开发利用的研究与实践[D].广西师范大学,2005.
[48]蒋美红.大学生思想政治教育中的激励方法研究[D].北京化工大学,思想政治教育,2013,硕士.
[49]何妍.辽宁省农业会展在推动现代农业发展中存在的问题及对策研究[D].中国农业科学院,农村与区域发展（专业学位）,2012,硕士.
[50]刘星.高校青年教职工住房问题分析及对策研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2012,硕士.