胆固醇包裹/携带let-7a miRNA模拟物对肝癌生长的体内外研究

【摘要】肝细胞性肝癌(肝癌)是世界上发生率排名第五,死亡率第三的恶性肿瘤。肝癌的侵袭力强,多数患者被确诊时己在中晚期。目前的治疗方法仅对30%患者有效,特别对于进展期肿瘤,临床上缺乏有效的治疗方法。近年来,有关MicroRNAs及其功能的研究给肝癌等恶性肿瘤的诊断治疗提供了新的思路。MicroRNAs是19-22个核酸的非编码RNA,不仅参与多个细胞生命重要过程如发育、分化、代谢等方面的调控,还与肝癌等恶性肿瘤的发生发展有密切关系。体内外研究提示MicroRNAs可能是肝癌等恶性肿瘤的潜在治疗分子。其中,let-7miRNA是最早被发现的家族之一。目前,let-7a在体外对肿瘤抑制作用的相关研究比较成熟。有文献报道,let-7可以通过调节RAS基因在肿瘤中发挥抑制因子的作用。let-7miRNA在肝癌中下调,并且与其肝癌的早期复发相关。但是,let-7a在体内对肝癌的治疗作用方面目前没有文献报道。因此,调控let-7及其靶基因RAS的表达有望成为肝癌治疗的潜在策略之一。但是,包括let-7家族在内,所有的MicroRNAs临床治疗应用都有相似的障碍,即缺乏可以引入人体内的安全有效的载体系统。因此,有效地生成或递送足够量的药物靶向进入肿瘤细胞是肝癌等恶性肿瘤靶向治疗的首要要求。近期,化学修饰如胆固醇或纳米包裹合成的miRNAs模拟物被用于miRNAs功能分析,多项实验结果证实其可在体内外发挥抑制肿瘤的作用。本课题组通过肝癌细胞体外转染胆固醇包裹let-7a模拟物发现,其转染效率明显高于单纯的模拟物,而且在正常裸鼠体内通过静脉给药后发现经胆固醇包裹let-7a的模拟物在肝脏区域呈现较高亲和性,因此,本研究在此基础上分为两个方面：首先,我们通过体外研究胆固醇包裹1et-7a模拟物对肝癌细胞系HepG2和SMMC7721细胞活性(生长、周期进展、迁移侵袭等方面的作用)和细胞超微结构的影响。通过体外MTT曲线、迁移实验、划痕实验、活细胞图像观察、以及电镜下观察,我们发现应用胆固醇包裹let-7a转染肝癌细胞,可以在体外水平抑制肝癌细胞的增殖、周期进展、侵袭迁移,促进细胞凋亡,破坏肿瘤细胞的超微结构。其次,我们研究了胆固醇包裹let-7a模拟物在体内对肝癌的抑制作用。我们构建了皮下移植瘤和肝原位移植瘤模型,研究let-7a模拟物通过局部多点注射和系统性静脉给药方式对肝癌生长、转移的作用。我们应用小动物超声检测肝原位肿瘤及其转移瘤的大小。裸鼠模型实验结束后,留取新鲜肿瘤组织用于电镜超微结构观察和组织病理学分析,并应用Realtime-PCR和Western杂交等方法进一步研究全身给药后,胆固醇包裹let-7a模拟物对肿瘤细胞内KRas,Hras,Nras的作用。我们发现通过皮下移植瘤模型局部多点注射,原位移植瘤模型尾静脉全身注射胆固醇包裹的let-7a模拟物,可以显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长和转移。同时,肝癌移植瘤实验组中Ras蛋白和mRNA的表达水平显著高于对照组。我们构建了Ras的野生型报告基因载体,通过野生型报告基因载体和let-7a模拟物共同转染肝癌细胞证实let-7a可以通过3’UTR区域的结合位点直接调控Ras基因的表达。本研究系统地证实了在体内外升高let-7a水平对肝癌具有明显的抑制作用。我们发现在体外转染肝癌细胞后可以抑制肝癌细胞的生长、迁移和侵袭；局部注射或静脉注射胆固醇包裹let-7a模拟物可以明显抑制肝癌移植瘤的生长和转移,降低let-7a的靶基因三种Ras的mRNA和蛋白水平。这提示这种化学修饰能够增强let-7a模拟物在体内外周血的稳定性,且对胆固醇受体丰富的肝组织具有较高的亲和性。胆固醇包裹let-7a模拟物通过体内静脉注射,能更快速有效地到达肝脏和原位肝癌移植瘤组织,并可以在一定时间持续保持let-7a高水平表达,对肝癌具有一定的靶向性治疗优势。本研究得到结论,let-7a模拟物对肝癌具有潜在的临床靶向治疗意义,胆固醇包裹可能是miRNAs较理想的潜在给药形式。
【作者】刘明洋；
【导师】陈杰；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】let-7a；静脉给药；裸鼠原位肝癌；Ras；甲基化修饰；超微结构；

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