共表达不同外源基因的重组弱毒Ⅰ型马立克氏病毒的构建和生物学特性比较

【摘要】马立克氏病毒(Marek′sdiseasevirus,MDV)是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosisvirus,REV)长末端重复序列(Longterminalrepeat,LTR)的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome,BAC)克隆，并构建了敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒。该基因缺失性MDV不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本文利用敲除meq基因的GX0101株MDV作为载体表达AIV-H9N2和NDV主要保护抗原基因，构建了2株敲除meq致肿瘤基因且同时表达2种不同外源基因的重组MDV。通过体内和体外连续传代分析这些重组MDV在细胞水平和动物体内的复制能力、探讨插入片段在重组MDV基因组中的稳定性、通过免疫SPF鸡这些重组MDV在体内诱导鸡的免疫应答的能力，从而为研发用于预防MDV和H9N2更好的疫苗提供候选疫苗株及相关的技术支持。研究主要从以下几个方面展开:1.荧光定量PCR检测1型MDV在不同感染阶段各组织中病毒含量的变化和分布。感染马立克病毒的鸡持续携带病毒一段时间后，可以增加器官肿瘤的发生率和提高横向传播的能力。鸡的马立克病毒含量与恶性肿瘤的发生率和作为感染性病毒的颗粒的唯一来源的羽毛囊上皮细胞中病毒传播水平呈有正相关的关系。本研究建立了一种SYBRGreen双重实时荧光定量PCR的方法，通过选择病毒的meq基因和管家基因-鸡卵铁转蛋白ovo来检测和量化发病鸡的马立克病毒的含量和不同组织病毒的分布。研究中分别用马立克基因组的BAC克隆，BAC-GX0101和携带管家基因-鸡卵铁转蛋白特异性基因片段的质粒(pMD18T-ovo)来定量病毒和宿主基因组。该方法具有1-8logs动态变化范围，其变化的平均值的批间和批内系数小于2%，并且MDV最小的检测含量为10拷贝。利用该方法绝对定量检测感染1000PFU的SDWJ1302菌株发病鸡的分别于7、14、21、28、40、60和90天取不同样品组DNA，空白组的鸡也作同样处理，并与常规的PCR检测方法的灵敏度进行比较。结果表明，感染鸡的免疫器官在感染7天后就可以检测到马立克基因的拷贝数，鸡的血液和不同器官在感染28天后是检测到马立克基因拷贝的高峰期，但40天后逐渐下降。在淋巴细胞，肝脏和脾脏的病毒载量水平均高于其它器官，并且在不同阶段羽毛囊上皮细胞的含量最高。研究数据进一步证明涉及病毒感染的多器官和免疫器官的主要分布，从而导致免疫抑制和免疫细胞的转化。这是首次对早期潜伏感染和发病后阶段的不同组织和器官的马立克基因组的拷贝数进行了绝对定量，应用此方法能有利于促进我们对马立克氏病的发病机机理、传播、诊断、遗传特性和疫苗控制的进一步认识。2.共表达H9N2-NA和NDV-F的meq缺失性重组马立克病毒的构建及其生物学特性研究本实验室以前的研究报道表明，在马立克氏病病毒(MDV)基因组的pp38基因和1.8kbmRNA之间的305bp是一个双向启动子，分别启动MDV的1.8kbmRNA转录子和pp38基因的表达（两个方向作用的启动子分别P1.8kb和Ppp38表示），该双向启动子可被MDV自身表达的pp38/pp24二聚体作为反式转录因子激活。为了构建能同时表达禽流感病毒H9N2株的NA基因和鸡新城疫病毒(NDV)的F基因的meq基因缺失型重组I型MDV，首先以真核表达性质粒pcDNA3.1为骨架，构建了重组表达性载体质粒pPpp38-NA/1.8kb-F。在该质粒中，NDV-F基因位于双向启动子上游，由P1.8kb启动；AIV-NA基因位于该双向启动子下游，由Ppp38启动。为了提供作为反式转录因子pp38/pp24二聚体，将重组质粒pPpp38-NA/1.8kb-F与包含pp38/pp24表达质粒pBud-pp38-pp24共转染CEF。用针对NDV-F和AIV-NA的小鼠血清，对转染细胞做间接免疫荧光反应（IFA），证明了在重组质粒pPpp38-NA/1.8kb-F中该双向启动子确实可同时调控这两个外源基因的表达。为了将NA和F基因共表达盒插入MDVUS2的非必要区，分别将MDV插入位点两侧序列并作为同源重组的两同源臂整合到NA和F基因共表达盒的两侧，构建成转基因重组载体质粒pPpp38-NA/1.8kb-F。PCR扩增同源重组大片段，将敲除了meq基因的GX0101(GX0101Δmeq)作为亲本病毒,在EL250大肠杆菌中通过同源重组将NA和F基因共表达盒插入GX0101Δmeq的US2非必要区，构建并筛选到重组MDV(MZC13NA/F)。IFA、ELISA和免疫印迹分析表明，重组病毒MZC13NA/F可在双向启动子的控制及MDV自身pp38/pp24二聚体激活下同时表达NDV-F和AIV-NA基因。MZC13NA/F的体外生长特性也说明，MZC13F/NA与其亲本病毒GX0101的CEF无显著差异。同时也表明,在1.8-kbmRNA转录方向的启动子活性高于pp38基因方向。用MDV的这个自身双向启动子构建并成功同时表达二个外源基因的重组MDV，不仅表明它可以作为一个有潜在利用价值的启动子，而且可在构建的重组MDV中减少外源DNA的插入。3.共表达H9N2-HA和-NA的meq缺失性重组马立克病毒的构建及其生物学特性研究为了构建能够表达来源于低致病性禽流感H9N2HA和NA，将野毒株GX0101作为亲本毒，通过同源重组的方法将强启动子CMV和SV40分别启动HA和NA共表达的串联大片段插入到GX0101基因组的meq位点取代meq基因，得到的病毒命名为MZC12HA/NA。体外进行rMDV和亲本毒GX0101生物学活性比较发现MZC12HA/NA与GX0101在CEF细胞的生长动态无明显差异。Southernbolt表明共表达盒成功插入到meq基因的双拷贝位点，meq基因完全被敲除。RT-qPCR显示HA和NA的mRNA转录水平显著高于MDV自身pp38mRNA的转录。ELISA检测显示HA和NA蛋白的表达也远远高于pp38蛋白的表达。IFA和westernbolt分析表明HA和NA能够同时表达，且检测不到meq基因的表达。结果表明，作为AIV-H9N2与MDV重组得到的MZC12HA/NA致肿瘤meq基因被删除，且能够高水平表达H9N2的抗原基因HA和NA。4.同时表达AIV-H9N2的HA和NA基因的MZC12HA/NA重组MDV的免疫原性MZC12HA/NA免疫SPF和海兰褐鸡，在鸡体内均能良好地复制，但复制能力弱；重组病毒免疫SPF鸡后能诱导滴度为2.0左右的H9N2抗体；重组病毒和H9N2对海兰褐的免疫应答有明显协同作用；免疫后SPF鸡H9N2的排毒实验，对H9N2的保护率为30%-35%，所以该重组病毒将来可能应用于抵抗MDV和H9N2感染的重组疫苗的筛选。
【作者】张振杰；
【导师】崔治中；
【作者基本信息】山东农业大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】重组马立克病毒；AIV-H9N2HA基因；AIV-H9N2NA基因；NDV-F基因；pp38双向启动子；

【参考文献】
[1]顾海迪.Tim-3分子在胃癌荷瘤个体NK细胞上的表达分析及临床意义[D].苏州大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[2]霍华德·芬伯格,王哲平,蔡雨晨.新闻业需要正确的生存技能——数字时代美国新闻业未来竞争力的调查[J].南方电视学刊,2014,06:115-119.
[3]顾熹豪.移动目标弱放射性检测与甄别研究[D].苏州大学,生物医学工程,2014,硕士.
[4]王小欢.马铃薯试管块茎形成有关的光敏感基因筛选与鉴定[D].华中农业大学,细胞生物学,2014,硕士.
[5]王宁波.红尾沙蜥和荒漠沙蜥体温调节的比较研究[D].兰州大学,生理学,2013,硕士.
[6]郭凤明.二次域Q(6~(1/2))的单位给出的两个递归数列中的形数问题研究[D].西南大学,基础数学,2014,硕士.
[7]蒲群莹.文本内容分析复合模型及其在情报研究中的应用[D].中国科学院研究生院（文献情报中心）,2005.
[8]樊晓鑫.体验营销在商业网球俱乐部实证研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[9]夏慕.亲子依恋对于大学生社交焦虑的影响[D].内蒙古师范大学,心理健康教育（专业学位）,2013,硕士.
[10]付鹏.治疗心血管疾病中药活性成分和西药对比及联合药物对预测[D].华东理工大学,生物化工,2014,硕士.
[11]厉虹,邹奎.基于T-S模糊模型的3D刚体摆姿态控制[J].控制与决策,2013,12:1786-1790+1798.
[12]黄璐.城市地铁车站光环境评价研究[D].西安建筑科技大学,系统工程,2013,硕士.
[13]邢靖贤.曲美他嗪对兔肺动脉高压致右心衰竭的心功能及心肌代谢的影响[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[14]赵兴华.领导—成员交换与员工创新行为关系的实证研究[D].新疆财经大学,企业管理,2013,硕士.
[15]李壹宏.一类波动方程的非经典势对称及群不变解[D].西北大学,基础数学,2014,硕士.
[16]冯天琦.我国农机行业投资策略研究[D].哈尔滨工业大学,金融,2014,硕士.
[17]刘海燕.校企手机一卡通业务管理系统的设计与实现[D].河北师范大学,计算机技术,2014,硕士.
[18]汪卫东.新型吸附材料在样品前处理技术中的应用研究[D].西南大学,2009.
[19]王永红.我国林权改革视阈下林权的法律构造论[D].西南政法大学,民商法,2012,硕士.
[20]高飞.1929-1949年甘肃人口研究[D].西北民族大学,专门史,2012,硕士.
[21]何齐聪.入世后我国施工行业发展战略研究[D].重庆大学,建筑与土木工程,2003,硕士.
[22]崔文静.清远凤塱古围村传统建筑研究[D].广东工业大学,设计学,2013,硕士.
[23]程昌利.几个生物体系的拉伸动力学模拟[D].东北师范大学,理论物理,2012,硕士.
[24]安丰涛.宣钢矩坯连铸工艺操作自动控制系统的开发[J].冶金自动化,2002,01:63-65.
[25]王清毅,史东辉,何兵,蔡庆生.线性关联规则研究[J].小型微型计算机系统,2001,11:1349-1352.
[26]刘辉,王海亮.中高职衔接的历史逻辑、现实困境及其超越[J].职业技术教育,2011,31:5-11.
[27]牛敏.论石黑一雄小说中的焦虑意识[D].首都师范大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[28]刘丰超.基于语料库的“nice and”和“good and”的重言法研究[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[29]张静.晋陕蒙制造业能源消费及碳足迹研究[D].内蒙古科技大学,企业管理,2013,硕士.
[30]周润山.河西地区魏晋十六国墓葬研究[D].郑州大学,考古学及博物馆学,2013,硕士.
[31]沈丽.基于.NET的健康体检信息管理系统的研究与设计[D].第四军医大学,生物医学工程,2014,硕士.
[32]朱照国.制度攸关视角下的乡镇领导职能行为研究[D].华中师范大学,行政管理,2012,硕士.
[33]田东震.第十九届足球世界杯决赛阶段球队进攻情况的分析研究[D].山东体育学院,体育教育训练学,2012,硕士.
[34]潘文荣,秦晖.基于招标投标价格指数变动趋势探究评标最优合理低价[J].价格月刊,2015,02:46-49.
[35]敬永锋.麻崖子特长隧道主洞与斜井交互段围岩受力与变形特征[D].长安大学,岩土工程,2013,硕士.
[36]白涛,吴智铭,杨根科.网络化控制系统中的抖动优化调度算法[J].控制与决策,2004,04:397-401.
[37]付勇1,2　尹治平1　吕国强1.一种Ku波段高增益双频双极化微带天线的设计[J].电子技术与软件工程,2015,08:52-53.
[38]李忠顺.霍尔果斯口岸对外贸易发展演变及前景展望[D].新疆师范大学,世界史,2013,硕士.
[39]李建成,邓林伟,蒋雪红,秦翠群.蔗糖酯造粒技术的研究[J].食品与机械.2002(02)
[40]石闻熙.平行文本在法律文本翻译中的使用[D].南京农业大学,英语笔译,2013,硕士.
[41]焦世新.银行业:成长伴随信息化——访中国进出口银行信息科技部王云生总经理[J].信息产业报道,2004,08:26-29.
[42]姜珊珊.I公司人力资源配置的问题与对策研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[43]冀鲁豫,吴俊勇,周艳真,郝亮亮,于之虹,严剑峰.基于WAMS受扰电压轨迹簇特征的电力系统暂态稳定性预测[J].高电压技术,2015,03:807-814.
[44]彭利.多模态输入方式对英语专业学生口头复述的影响研究[D].扬州大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[45]兰辛键.针刺深度不同对神经性耳鸣患者临床疗效观察[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[46]刘红坡.光响应性偶氮苯生色团/石墨烯复合物的制备[D].天津大学,2012.
[47]朱六璋,袁林,黄太贵.短期负荷预测的实用数据挖掘模型[J].电力系统自动化,2004,03:49-52.
[48]曾清华.纸厂废弃麦秸末腐熟合成基质的工艺参数筛选及其在蔬菜作物上的应用[D].南京农业大学,蔬菜学,2011,硕士.
[49]王祎好.谨慎性的“非对称性”视角下财务指标改进研究—从投资者的角度出发[D].兰州商学院,会计学,2014,硕士.
[50]王彦芬.两种芋病毒的检测及分子生物学特性研究[D].华中农业大学,植物病理学,2014,硕士.