水稻黄单胞杆菌的分子标记与致病相关因子的鉴定

【摘要】水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病（简称水稻条斑病）是水稻上最重要的两个细菌性病害,在我国乃至东南亚的某些地区甚至成为主要病害,危害巨大。其病原菌分别是Xanthomonasoryzaepv.oryzae（Xoo）和X.oryzaepv.oryzicola（Xoc）,同属于稻黄单胞杆菌,具有非常近的亲缘关系,在形态特征以及生理生化性质上十分相似。在病害防治中如初始菌量的调查、病菌数量的统计以及日常的种子检验检疫中经常造成困难,因此需要方便、快捷及准确的鉴定方法。本研究利用生物信息学技术构建了比较基因组学算法,并且基于现有的全基因组序列对Xoo和Xoc进行分析,获得了一系列的用于区分水稻白叶枯病菌与条斑病菌病菌的电子分子标记917对,对其中三种类型的多态性标记（Xoo特异性、Xoc特异性、Xoo和Xoc共显性等）随机选取了130对在40个已得到鉴定的菌株中进行了实验分析,分别获得30对Xoo特异性的分子标记,24对Xoc特异性分子标记,14对Xoo和Xoc共显性的分子标记。这些特异性分子标记可直接应用于检验检疫工作,并可发展多标记协同检测方法,提高了检测准确性。同时,本研究对水稻条斑病菌中特异的Ⅲ型分泌效应蛋白AvrRxo1进行了研究,开发出相关特异的分子标记。AvrRxo1是一类non-TAL类效应因子,其生物学功能未知。本研究利用烟草瞬时表达体系发现,表达AvrRxo1对非寄主烟草细胞具有毒性功能,同时来源于不同Xoc菌株的avrRxo1等位基因的毒性功能存在差异。通过分析五个菌株来源的AvrRxo1的氨基酸序列并结合定点突变验证,明确了AvrRxo1蛋白的第344位丝氨酸对其毒性功能具有重要作用。进一步对AvrRxo1蛋白分别从氨基端和羧基端进行截短实验以及预测的关键功能结构域位点进行突变实验,明确了AvrRxo1蛋白羧基端的完整性对其毒性功能的发挥是必需的。此外,前期研究暗示水稻白叶枯病菌可能代谢产生IAA并将其作为侵染水稻的致病因子。本研究利用同源重组的方法在PXO99A中获得了四个预测与IAA合成相关基因的突变菌株：P△pxo04004、P△pxo04823、P△pxo00867和P△pxo03584。利用高效液相色谱仪对野生型菌株PXO99A及其四个突变菌株的代谢产物进行了检测分析。结果显示,PXO99A可以代谢生成IAA,产量约为2.6μg/ml,而其突变体代谢IAA产量显著降低,证明了水稻黄单胞菌中存在多种IAA合成途径。与预期相反,致病力检测发现4个突变菌株相比于野生型PXO99A致病力显著提高。对突变菌株的生理生化进行检测,发现四个突变菌株的重要的致病因子之一胞外多糖（EPS）的产量得到提高。双向电泳技术的初步分析也显示了突变菌株在分泌蛋白分泌量和种类上与野生型相比也存在差异,有望揭示IAA负调控黄单胞杆菌致病因子合成的机制。综上所述,本研究开发了大量鉴别Xoo和Xoc的PCR标记,并对其中一个分子标记的靶标基因avrRxol的致病性功能进行了分析。同时鉴定了Xoo中存在IAA的合成途径,并证明其参与负调控黄单胞杆菌致病因子合成。相关研究结果有望在植物检疫、病害防控上发挥一定的作用。
【作者】冯雯杰；
【导师】储昭辉；
【作者基本信息】山东农业大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】水稻白叶枯病菌；水稻细菌性条斑病菌；分子标记；效应因子；AvrRxol；IAA；

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