劳力性热射病致脑损害的临床分析及相关机制的实验研究

【摘要】研究背景和目的随着全球气候变暖以及热浪袭击频率和强度的逐年增加,热射病(heatstroke,HS)的发病率明显增加。热射病如未得到正确救治,可能导致严重的多脏器损害,病死率高达10%～50%。脑损害表现是热射病早期的临床特征,患者可有不同程度的脑损害表现,最常见临床表现为昏迷、抽搐、谵妄等。部分幸存者会遗留永久性中枢神经系统损害,发生率可达20-30%。目前,热射病导致脑损害的病理生理机制尚不完全明确。在遭受热打击后的狒狒和大鼠的脾脏、淋巴组织和肠道等部位发现大量细胞凋亡。细胞实验观察到了热刺激后神经元凋亡的证据。热应激诱导的氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)水平爆发性增加诱导细胞凋亡已在细胞实验中被证实。但目前对于高热诱导ROS如何介导神经元凋亡的中间机制没有进一步深入的研究报道。核因子κB(NuclearfactorκB,NF-κB)家族参与了多种凋亡相关基因的转录调控。KIM等研究发现大鼠大脑皮层和海马神经元内含有高活性的NF-κB。NF-κB是否也参与了高热导致大脑氧化应激反应以及氧化应激反应诱导的神经元凋亡过程,有待深入研究。鉴于以上现状,本研究首先对近十年我院收治的劳力性热射病患者的临床资料进行回顾总结,通过分析其脑损害临床特征、神经影像学表现以及其它临床特征,总结热射病脑损害的规律,探讨临床策略。此外,通过建立热打击中暑小鼠动物模型和神经元热打击模型,探讨高热与神经元凋亡的相关性及相关信号通路,以进一步揭示热射病脑损害的机制,为寻找新的防治方法提供理论依据。第1部分劳力性热射病致脑损害的临床分析方法回顾性分析广州军区广州总医院重症医学科2004年5月～2013年9月收治的劳力性热射病病例。根据预后分为存活组及死亡组,前者按出院时是否遗留脑损害后遗症分为痊愈组及后遗症组两个亚组。记录各组患者的人口学资料、起病后最高体温、降温至38.5℃以下所耗时间、脑损害临床表现、头颅MRI或CT检查发现、出院时遗留的脑功能缺陷以及起病早期和入院72小时内其它重要脏器损害情况。采用SPSS17.0统计软件包对数据进行统计分析。组间计数资料比较采用Kruskal-WallisH检验,计量资料比较使用方差分析并用Levene法进行方差齐性检验。使用Kaplan-Meier法计算生存组和死亡组30天生存率,组间生存曲线比较采用log-rank检验。P<0.05为有显著性差异。将两组间单因素分析有意义的指标引入多因素COX回归,筛选预后危险因素。结果共纳入劳力性热射病126例,死亡19例(12.3%),生存107例,其中有15例(11.9%)出院时遗留脑损害后遗症。三组患者入院前最高体温差异无统计学意义(P>0.05)；死亡组延迟降温(降温耗时：2-4小时)及严重延迟降温(降温耗时>4小时)的比例最高,其次是后遗症组,三组患者降温速度差异有统计学意义(P<0.05)。不同降温速度对住院30天生存率影响有统计学差异(P<0.05)。三组患者起病后原发意识障碍程度的差异无统计学意义(P>0.05),轻度意识障碍、中度意识障碍及重度意识障碍患者住院30天生存率总体比较差异无统计学意义(P>0.05)。95例(75.4%)在24小时内神志恢复,18例(14.3%)在2-5d内神志恢复,13例(10.3%)原发意识障碍程度逐渐加重。痊愈组、后遗症组和死亡组意识障碍持续时间差异有统计学意义(P<0.05),原发意识障碍持续时间>24小时与原发意识障碍持续时间<24小时患者住院30天生存率差异有统计学意义(P<0.05)。头颅MRI/CT检查发现19例出现脑部病变,其中9例为弥漫性病变,均为死亡组,包括弥漫性脑肿胀7例、大脑半球梗塞并脑疝1例、小脑及脑干梗塞1例。出现局灶性脑内(顶叶、颞叶、小脑)出血6例。出现脑内局灶性点状或片状异常信号4例,均在T2加权成像、FLAIR序列和DWI加权成像呈高信号,点状病变位于侧脑室前角旁白质和放射冠,片状病变位于海马回、海马旁回和岛叶。起病24小时内发生血小板减少的28例(22.2%),其中死亡组14例,早期出现血小板减少与未出现血小板减少患者生存率总体比较有显著差异(P<0.05)。入院72小时内发生弥散性血管内凝血(DIC)26例(20.6%),其中死亡组14例,入院72小时发生DIC的患者较未发生DIC患者的生存率总体比较有显著差异(P<0.05)。入院72小时内发生急性肝功能衰竭53例(42.1%),其中死亡组10例,肝脏衰竭对热射病患者住院30天生存率无明显影响。入院72小时内发生急性肾功能衰竭41例(32.5%),其中死亡组8例,肾功能衰竭对热射病患者住院30天生存率无明显影响(P>0.05)。入院72小时内发生肺衰竭22例(17.5%),其中死亡组中9例,肺衰竭患者30天生存率明显低于无肺衰竭的患者(P<0.05)。24例(19.0%)患者入院前曾有低血压,其中死亡组7例,入院前发生低血压对住院30天生存率有显著影响(P<0.05)。入院72小时内22例(17.5%)患者出现休克,其中死亡组12例,发生休克患者30天生存率低于未发生休克患者(P<0.05)。入院72小时内发生横纹肌溶解症108例(85.7%),其中死亡组19例,发生横纹肌溶解对住院30天生存率无显著影响(P>0.05)。多因素COX模型分析结果显示影响热射病患者30天生存的危险因素包括休克(RR3.219；95%CI:1.097～9.444；P=0.033).原发意识障碍持续时间>24h(RR5.247；95%CI:1.419～18.473；P=0.027)和降温时间(RR3.241；95%CI:1.407～7.466；P=0.0061结论热射病患者原发意识障碍程度无明显差别,多数患者会在起病后24小时内意识恢复。原发意识障碍持续时间>24h是影响热射病患者30天生存的危险因素。少部分热射病患者MRI检查发现脑部病变,可分为弥漫性病变(包括弥漫性脑肿胀和广泛的脑梗塞)、脑内出血和局灶性点状或片状变性。点状异常信号位于侧脑室前角旁白质和放射冠,片状异常信号位于海马回、海马旁回和岛叶,这些部位是热射病脑损害的易感部位。影响热射病患者30天生存的危险因素还包括休克和降温时间。第2部分高热诱导大脑皮层神经元凋亡的实验研究方法1、动物实验6-8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为对照组(30只)和热打击组(60只)只。对照组动物始终置于常温下,热打击组置于仿真气候舱内,舱内温度(35.5±0.5)℃,湿度(60±5)%,每30min用肛温表测小鼠直肠温度,当小鼠体温达到41.5℃时,每10min测小鼠直肠温度,小鼠体温达到42℃即停止热打击,置于常温下复温。热打击组按复温时间Oh、3h、6h、12h每次随机抽取12只小鼠分别编为复温Oh、3h、6h、12h组。各组在达到复温时间点后随机抽取6只小鼠处死,于冰上取大脑脑组织,行组织切片及神经损伤病理评分,提取组织总蛋白用于免疫组织化学检测各组小鼠大脑皮质组织内caspase-3的表达、WesternBlotting检测各组小鼠大脑皮质组织内p-NF-kB65和活化caspase-3的表达、荧光分光光度计法检测各组小鼠大脑皮质组织ROS含量。各组其余6只小鼠用2.5%戊二醛行活体内固定,固定成功后于冰上取大脑脑组织,用于透射电子显微镜观察。2、细胞实验将神经元细胞分为对照组和热打击组,对照组将细胞置于标准37℃、5%C02细胞培养箱,热打击组将细胞置于39℃、41℃、43℃细胞培养箱中进行热打击2h,热打击后继续标准37℃、5%C02细胞培养箱孵育12h。CCK-8法检测各组神经元存活率(热打击组分为39℃、41℃、43℃、45℃组)；Hoechst33258荧光核染色法和AnnexinV/PI流式细胞术两种方法检测各组神经元凋亡情况；WesternBlot分析热打击后神经元细胞活化的caspase-3和p-NF-KB65蛋白表达；DCFH-DA探针标记联合流式细胞仪分析细胞内ROS水平。为了进一步观察NF-κB在热打击诱导细胞凋亡中的作用,研究中使用NF-κB活性抑制剂PDTC(20fμl)预处理细胞,观察PDTC对热打击诱导神经元细胞凋亡的影响,同时分析了PDTC对热打击诱导caspase-3蛋白活化的影响。为证实ROS在热打击诱导细胞凋亡中的关键作用,使用ROS特异性清除剂MnTMPyP预处理细胞,分析MnTMPyP对热打击诱导细胞凋亡、p-NF-KB65蛋白和活化caspase-3蛋白表达的影响。3、统计学处理使用GraphpadPrism及SPSS17.0统计软件进行统计分析。服从或近似正态分布的计量资料采用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分率表示,采用x2检验。P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1、动物实验1.1光镜下观察各组小鼠大脑皮质组织病理学变化：对照组及热打击后复温0h组,小鼠大脑皮质内神经元形态正常,细胞排列较为整齐、形态完整；复温3h后小鼠大脑皮质出现散在的细胞体积缩小、细胞深染与皱缩,细胞核固缩深染；复温6h和12h后大脑皮质出现多数细胞排列散乱,细胞核染色质固缩深染、核固缩深染。神经病理损伤评分,对照组比较和热打击组复温0h神经元损伤评分均较低,两组间比较无统计学意义；随着复温时间的延长,6h和12h神经元损伤评分逐步增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。1.2透射电子显微镜下观察：对照组和热打击复温0h组,小鼠大脑皮质内神经元未检测到凋亡现象,神经元结构清晰完整,核膜完整,核染色质颗粒细致、分布均匀；热打击复温3h、6h及12h组检测到了凋亡现象的存在,凋亡细胞染色质固缩,呈斑状块状聚集于核膜周边,胞浆浓缩,核膜皱折。1.3免疫组化定位观察各组大脑皮质中caspase-3:对照组与热打击后复温Oh组小鼠大脑皮质caspase-3表达无明显差异；热打击后复温3h组开始出现caspase-3阳性表达,复温6h组其表达明显增多,且持续到复温12h组(P<0.05)。1.4WesternBlotting检测各组大脑皮质中活化caspase-3和p-NF-kB65表达：发现对照组小鼠大脑皮质caspase-3基本没有出现活化条带,复温0h开始出现,随着复温时间的延长caspase-3活化呈时间依赖性增强(P<0.05)；与对照组比较,p-NF-kB65蛋白表达在热打击后3h明显增强,6h表达达到峰值,到复温12h表达有所下降。1.5各组大脑皮质ROS含量：热打击组复温0h、3h、6h、12h组ROS含量较对照组明显升高(P<0.05),其升高趋势在热打击后复温3h达到峰值,随着复温时间的延长在6h和12h有所下降。2、细胞实验2.1CCK-8法检测各组神经元存活率：与对照组相比,39℃热打击对神经元活力无影响；但随着热刺激温度的增高(41℃-45℃),神经元的活力呈现进行性下降,与对照组(37℃)比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.2热打击对神经元凋亡的影响：Hoechst33258荧光核染色法检测各组神经元凋亡表达,与对照组相比,39℃热打击对神经元凋亡无明显影响,随着热打击温度的升高(41℃-43℃),染色阳性的细胞核逐渐增加；AnnexinV/PI流式细胞术检测,发现39℃热打击对神经元凋亡无明显影响,随着热打击温度的增加神经元凋亡逐渐增多,41℃凋亡率为10.19%,43℃凋亡率急剧上升到43.02%,与对照组37℃比较有统计学意义(P<0.01)。2.3Westernblot检测凋亡关键蛋白caspase-3及p-NF-KB65的表达：与对照组相比,39℃热打击对其表达无明显影响,随着热打击温度的增加caspase-3及p-NF-KB65蛋白的表达逐渐增强,其表达趋势与神经元凋亡一致。2.4DCFH-DA法检测各组神经元内ROS表达：与对照组37℃比较,热打击39℃对细胞内ROS水平无影响,随着热打击温度的增加,细胞内ROS水平明显增加,41℃和43℃热打击分别增加了近7倍和15倍。2.5NF-κB活性抑制剂PDTC对热打击诱导凋亡的影响：与43℃热打击组(41.67%)相比,PDTC预处理+43℃热打击组神经元细胞凋亡率(11.20%)明显减少,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。Westernblot检测发现,PDTC预处理后明显抑制了热打击诱导的活化caspase-3蛋白的表达(P<0.01)。2.6ROS特异性清除剂MnTMPyP对热打击后诱导凋亡的影响：与43℃热打击组(47.42%)相比,MnTMPyP预处理+43℃热打击组神经元凋亡率(18.45%)明显减少,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。Westernblot检测发现,MnTMPyP预处理后明显抑制了caspase-3及p-NF-KB65蛋白的表达(P<0.01)。结论：1、热打击可以诱导神经元发生凋亡；神经元凋亡发生与热打击强度及神经元损伤持续时间相关。2、热打击诱导神经元内ROS爆发性增高作为上游信号,通过中间枢纽NF-κB信号通路,介导了神经元凋亡的发生。3、热打击后脑神经元发生凋亡可能是介导热射病脑损害的后续发展并导致脑损害后遗症发生的机制之一。总结：通过对126例劳力性热射病病例进行回顾性分析后发现：热射病患者原发意识障碍程度无明显差别,多数患者会在起病后24小时内意识恢复。原发意识障碍持续时间>24h、休克和降温时间是热射病患者30天死亡的危险因素。少部分热射病患者MRI检查发现脑部病变,可分为弥漫性病变(包括弥漫性脑肿胀和广泛的脑梗塞)、脑内出血和局灶性点状或片状变性。点状异常信号位于侧脑室前角旁白质和放射冠,片状异常信号位于海马回、海马旁回和岛叶,这些部位是热射病脑损害的易感部位。在建立热打击中暑小鼠动物模型和神经元热打击模型基础上研究发现：热打击诱导神经元内ROS爆发性增高作为上游信号,通过中间枢纽NF-κB信号通路,介导了神经元凋亡的发生。神经元凋亡的发生与一定程度的热打击强度相关。
【作者】刘云松；
【导师】苏磊；
【作者基本信息】南方医科大学，急诊医学（专业学位），2014，博士
【关键词】劳力性热射病；脑损害；回顾性分析；生存分析；热打击；神经元；凋亡；活性氧；NF-κB/p65；

【参考文献】
[1]刘玲丽.锌对青花菜幼苗生长及光化学效率的影响[D].甘肃农业大学,蔬菜学,2013,硕士.
[2]薛昭,董良国,单联瑜.Radon变换去噪方法的保幅性理论分析[J].石油地球物理勘探,2012,06:858-867+1024+837.
[3]付烨.关于语篇分析理论在综合英语课文教学中的应用研究[D].内蒙古师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[4]叶亚军.农村中小学教师流失问题研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[5]刘婷.探析维尼亚夫斯基《随想曲与现代练习曲》(Op.10)的旋律形态与演奏技巧[D].上海大学,音乐学,2014,硕士.
[6]魏晓旭.人教版高中语文词语注释研究[D].河北师范大学,语言学及应用语言学,2012,硕士.
[7]童晓慧.PDA型移动地理信息终端的设计与实现[D].华东师范大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[8]何难.地级市科技成果的转化问题和对策研究[D].湖南师范大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[9]周绍杰.F塑料模具企业的MES系统构建与应用研究[D].吉林大学,工业工程,2013,硕士.
[10]夏天光.抑郁症患者血清脑源性神经生长因子、皮质醇及其比值的变化和临床意义[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[11]周丹丹.小学亲子阅读的推进策略研究[D].西南大学,课程与教学论,2013,硕士.
[12]杨玉梅.我国养老保险基金监管问题研究[D].山东师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[13]张建英.主存数据库技术研究及一个原型系统的构造[D].大连理工大学,计算机软件与理论,2003,硕士.
[14]余琪.基于EVA的我国央企上市公司绩效评价实证研究[D].武汉科技大学,会计学,2012,硕士.
[15]杨娜.基于脉冲耦合神经网络的车辆图像分割研究[D].北京交通大学,2013.
[16]王丽娜.不同形貌金属氧化物的水热合成及其电化学性能研究[D].西北大学,2014.
[17]柯明月.金刚石颗粒表面镀覆铬包覆层的研究[D].广东工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[18]杨大伟.经肝动脉和门静脉2种不同途径移植骨髓间充质干细胞对重症肝硬化大鼠模型疗效的对比[D].大连医科大学,内科学,2012,硕士.
[19]付建军.HSE07型摆动液压马达的结构与强度分析[D].内蒙古科技大学,机械工程,2014,硕士.
[20]弓剑.我国高收入者个人所得税征管现状、原因及对策研究[D].中国海洋大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[21]王维佳.政府投资建设项目跟踪审计的风险研究[D].浙江大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[22]曲泰霖.中石油工程技术服务公司发展战略研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[23]徐丽云.一位农村小学初任教师专业发展的个案研究[D].西南大学,教育学原理,2014,硕士.
[24]卜军,曹阳,孙毅.四川电视台12讯道大型数字转播车[J].广播与电视技术.2005(12)
[25]孙冬冬.凹泛函型拉伸与压缩不动点定理及应用[D].东北大学,基础数学,2010,硕士.
[26]陈荣彬.现代嘉庚建筑的风格设计研究[D].华侨大学,建筑学（专业学位）,2014,硕士.
[27]邓萍萍.社区管理模式创新研究[D].吉林大学,公共管理,2013,硕士.
[28]邱志明,朱兆芳,黄大健.上海城市外环线莘庄立交的选型与优化[J].上海建设科技.1998(02)
[29]龙凤雏.基于遗传算法的列车最佳惰行点优化研究[D].北京交通大学,2014.
[30]陈宏宇.EVAR中保留髂内动脉的腔内治疗方法[D].福建医科大学,外科学,2014,硕士.
[31]王迪.对外汉语新手教师与专家教师课堂教学行为比较研究[D].北京外国语大学,对外汉语教学理论,2014,硕士.
[32]潘璇.乡村社会个体化背景下农村老年人的生活变革[D].华中师范大学,政治社会学,2014,硕士.
[33]段璐瑶.洞庭湖区生态城镇化发展水平评价与对策研究[D].湖南师范大学,人口、资源与环境经济学,2014,硕士.
[34]徐明明.基于TOD与SOD模式下城市轨道交通枢纽交通换乘布局研究[D].北京交通大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[35]杨琴琴.长江航运多模无线传输方案与实现[D].华中科技大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[36]廖伟雄.双向凝胶电泳联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析在膝关节骨性关节炎滑液蛋白质组学研究中的应用[D].中国人民解放军医学院,骨外科,2013,硕士.
[37]张琰飞.新兴技术研发主体间协同创新效应实现机制研究[D].中南大学,管理科学与工程,2014,博士.
[38]王思谊.电磁波与石墨烯—介质结构的相互作用[D].上海交通大学,2014.
[39]胡龙.我国生态安全的环境伦理维度考察[D].北京化工大学,科学技术哲学,2013,硕士.
[40]蒋莉莉.体育明星报道的受众研究[D].黑龙江大学,新闻与传播,2013,硕士.
[41]李娜.顺应论视角下化妆品品牌名称的汉译研究[D].广东外语外贸大学,商务英语研究,2013,硕士.
[42]徐秀连.Aurka、LGR5以及SDF-1在胃癌中的表达变化及其临床病理相关性的研究[D].川北医学院,外科学,2013,硕士.
[43]冯云超.甘草及无花果双水相萃取物的酪氨酸酶抑制及抗氧化活性研究[D].华中科技大学,无机化学,2013,硕士.
[44]唐意.广告干预对消费者品牌回避的影响[D].宁波大学,应用心理学,2013,硕士.
[45]赖厚湖.短间隙高压气体放电光谱检测与分析[D].哈尔滨理工大学,仪器仪表工程,2013,硕士.
[46]赵明.新农村建设背景下乡镇政府公共服务能力提升研究[D].湖南师范大学,行政管理,2013,硕士.
[47]刘军.高精度波前过程检测技术的研究[D].浙江大学,光学工程,2004,硕士.
[48]魏然红.Cauchy-三次函数方程的Hyers-Ulam稳定性[D].青岛大学,基础数学,2013,硕士.
[49]睢利铭.平模式生物质成型机的改进设计与试验分析[D].河南农业大学,农业机械化工程,2012,硕士.
[50]刘伟.植物纤维基铬六离子吸附材料的制备与吸附性能研究[D].齐鲁工业大学,制浆造纸工程,2014,硕士.