肾上腺醛固酮瘤信使RNA（mRNA）和长链非编码RNA（LncRNA）差异表达及调控关系的研究

【摘要】原发性醛固酮增多症(primaryaldosteronism,PA)是指由于肾上腺皮质自主性醛固酮分泌增多而导致的以高血压、低血浆肾素活性、高醛固酮血症为特征的临床综合征。与原发性高血压相比,PA患者血压更难控制,更易发生心肌肥厚、脑卒中和心肌梗死。近年来一些研究报道原发性醛固酮增多症(PA)在高血压人群中的患病率为5%-15%,在难治性高血压患者中占17%-20%。高血压的诊治费用已经成为国家和个人医疗支出的沉重负担。若按该病占高血压人口的6%计算,我国1.6亿高血压患者中就有960万系PA所致,这是动摇原发性高血压患病比例的重大问题,但我国目前每年证实的PA患者估计不到1万例,如果这么多PA因漏诊被归于原发性高血压,会贻误病情,失去治疗机会,浪费医疗经费。原醛症(PA)中最常见的两个亚型分别为：特发性醛固酮增多症(Idiopathichyperaldosteronism,IHA)和产醛固酮腺瘤(Aldosterone-producingadenoma,APA),其中,HIA占50-60%,APA占40～50%,两者占PA的95%以上,前者可采用药物治疗,后者多采取手术治疗基本控制血压。绝大多数早期APA患者通过手术治疗可以达到治愈的效果。然而,导致醛固酮高分泌的机制不清,使得目前原醛症的诊断程序繁锁,诊断方法复杂,诊断周期较长,早期诊断困难,很多患者治疗效果不佳,血压控制不理想。肿瘤的发生发展必然伴随着肿瘤组织形态学和功能学的改变,形态学的变化可以通过光镜和电镜观察研究,功能学的变化则要通过分子生物学技术揭示发病机制。近10年来,人们发现了很多种类的新型非编码RNA(non-coding,RNA,即ncRNA),并揭示了一些非编码RNA在基因调控网络中发挥的重要作用。人类基因组中研究最清楚的是编码蛋白质的基因。然而,这些编码基因的外显子只占整个基因组的1.5%,即使算上非编码区(untranslatedregion,UTR)比例也不过2%。近年来,越来越多的研究表明,基因组中非编码蛋白质区段同样发挥着重要的作用：不仅作用于正常的生长发育和生理过程,而且会参与和疾病有关的机制。比如,microRNA通过降解mRNA或阻止转录造成基因沉默,在人类疾病特别是癌症中都有作用,它产的表观遗传修饰和遗传缺陷和它们的加工过程构成一些疾病的普遍特点。然而,microRNA只是冰山一角,还有很多不同的ncRNA可能也与人类疾病相关,比如核糖体小RNA(snoRNA、T-UCRs、piRNAs、长的基因间ncRNA(lincRNAs)、多种类型拼接起来的lncRNA。mRNA是指携带遗传信息,在蛋白质合成时充当模板的RNA,它是从脱氧核糖核酸(DNA)转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸(RNA),它在核糖体上作为蛋白质合成的模板,决定肽链的氨基酸排列顺序。而长片段非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,不具有编码蛋白质功能,但在基因表达调控方面发挥着十分重要的作用。大量的研究表明,lncRNA数量庞大,且调控的方式多种多样,它在剂量补偿效应(Dosagecompensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。目前对lncRNA的致病机制还知之甚少,但大量临床观察和实验证据显示,lncRNA可能通过基因印记(Geneticimprinting)、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等方式,参与物种进化、胚胎发育、干细胞的维持、细胞的增殖分化以及肿瘤的发生等多种重要的调控过程。许多学者通过综合已经注释其功能的lncRNA数据和实验室收集的转录组测序,即RNA测序(RNAsequencing,RNA-seq)数据,发现4662种lncRNA中的大多数具有高度的组织特异性,说明它们在疾病诊断上具有较好的应用前景。研究APA的发病机制,发现新的、适用于高危人群筛查,具有较高特异性和灵敏性的诊断方法是提高PA确诊率,尤其早期确诊的重要途径。研发新的治疗药物,是控制患者症状和血压,提高生存质量的重要手段。现有的研究表明,lncRNA与一些复杂疾病有关。早在20世纪90年代H19就被发现与癌症有关,它是第一个被发现与癌症相关的RNA,也是第一个被发现的作为印痕基因的非编码转录本产物,它既有抑癌的作用又起促癌生成的作用。此后,人们陆续发现与冠心病相关的lncRNA(ANRIL),还发现其他一些与癌症有关的lncRNA,如PCGEMl,MEG3,p15AS和HOTAIR等,甚至发现一些lncRNA如PCA3,MALAT1还是一些肿瘤特异性生物标记物。然而,肾上腺醛固酮瘤的发病机制仍然处于研究阶段,至于lncRNA是否参与了APA的发生、发展过程及其作用机制尚未有研究涉及。因此,探讨APA发生发展过程中lncRNA的表达谱变化,有助于：(1)发现可能的特异性APA相关lncRNA分子标记物,便于PA的早期诊断。(2)发现可能与APA发生发展相关的重要调控因子,为进一步揭示PA发生发展的机制,探究APA治疗的新靶点提供理论依据。由于APA占PA比例较高,约为40-50%,而且标本相对IHA容易获得,所以本研究以APA为基础,利用基因表达谱芯片技术、RT-PCR技术和生物学信息分析技术,研究APA发生发展过程中lncRNA、mRNA差异表达的情况,探讨APA高分泌的可能机制,为进一步研究肿瘤标记物和药物作用靶点提供了实验证据。研究共分四个部分第一部分肾上腺醛固酮瘤(APA)病理学研究研究目的及意义明确所收集6例醛固酮瘤标本和6例正常肾上腺标本的病理类型和病理特点,确定是否符合实验入组标准。研究醛固酮瘤和正常肾上腺皮质电镜下超微结构特点,总结醛固酮瘤的组织形态、超微结构变化特点,为进一步研究醛固酮瘤细胞功能变化提供形态学依据。研究方法选取6例经病史、临床表现、生化检查、影像学检查和术后病理检查明确诊断为肾上腺醛固酮瘤病例作为实验组,另选取肾癌根治术切取的肾上腺,经病理证实为正常肾上腺组织的6例病例作为对照组。入选的12例标本每例分为三份,一份用4%多聚甲醛固定,行病理HE常规染鱼,一份用2.5%电镜级戊二醛固定,行透射电镜观察,一份在手术切下标本后即刻放入液氮中冷冻、保存,为行DNA、RNA和蛋白质抽提备用。研究结果1、正常肾上腺组织学检查结果正常肾上腺球状带细胞为较小的柱状或多边形,细胞核呈圆形染色深,胞质较少染色略深,含少量脂滴。细胞排列呈细胞团,缺乏明确界限,有时表现为不连续性和不明确的转入束状带。细胞团间有窦状毛细血管和少量结缔组织。2、醛固酮瘤病理学检查结果肿瘤大体观一般较小,直径2-3cm大小。圆形或卵圆形,多单发。肿瘤边界清楚,似有包膜(但是,显微镜下观察多数肿瘤并无完整的包膜,而是肿瘤挤压周围组织形成的边界,即假包膜。)。切面实性,亮黄或金黄色。组织学上,肿瘤组织排列成巢状、腺泡样、短条索、交叉的小梁状和混合性结构。肿瘤细胞形态、大小可有差异。部分肿瘤细胞体积相对较小,胞质内脂质成分也少,似球状带细胞；部分肿瘤细胞体积相对较大,胞质内脂质成分丰富,似束状带细胞(但是比正常的束状带细胞大)；有些肿瘤细胞排列紧密,胞质嗜伊红染色,似网状带细胞；还有第四种细胞,即“杂交细胞”(“hybrid”cell),细胞同时具有球状带细胞和网状带细胞的特征(激素分泌也兼具两种细胞特征)。四种成分在不同的肿瘤中所占比例各不相同,一般胞质内富含脂质体积较大的细胞最常见。另外,偶见小簇状分布的胞质内含大量脂质的所谓的气球样细胞(so-calledballooncell)。肿瘤细胞核一般无异型或只有轻度异型。和在其它内分泌肿瘤中一样,可见明显核异型,但这既不影响诊断又不代表恶性。肿瘤同侧或对侧的肾上腺皮质常显示球状带细胞增生,非肿瘤性球状带细胞的胞质中可见嗜酸性的“卷纸样”包涵体,即安体舒通小体(spironolactonebodies)。3、正常肾上腺透射电镜结果正常肾上腺皮质球状带细胞透射电镜下见胞质内的线粒体多,呈长形,嵴为板状或管状,高尔基复合体明显,滑面内质网不丰富,互连成网,分散在整个细胞质内,粗面内质网则很少,有许多游离多聚核糖体,大都位于脂滴附近,还有大颗粒糖原,溶酶体较少。相邻细胞的细胞膜呈交错相接,邻近毛细血管的细胞表面有微绒毛。4、醛固酮瘤电镜结果醛固酮瘤细胞在电镜下显示：细胞表面微绒毛增多；瘤细胞核以常染色质为主,核仁明显；胞质中见管泡状滑面内质网,短股的粗面内质网,细胞间关系密切见中间连接；球形、长形线粒体并具有长管泡状嵴、高尔基复合体明显、小堆状平行排列的粗面内质网,富含大而密集的脂滴,细胞器密度较高,主要为线粒体,有明显的脂褐素颗粒。研究结论1、经病理HE染色证实,6例正常肾上腺标本和6例醛固酮瘤标本完全符合病理上对于醛酮瘤和正常肾上腺的诊断标准。从细胞的形态结构判断,瘤细胞分泌功能旺盛,增殖能力较强。2、电镜下醛固酮瘤的表现说明：醛固酮瘤细胞的胞质和胞核均有变化,以胞质变化更为明显,在胞质的细胞器中线粒体变化最为明显,其次是内质网的变化,小堆状平行排列的粗面内质网,大量脂滴聚集。这些变化都充分说明,醛固酮瘤细胞处于高分泌、高代谢状态。第二部分醛固酮瘤mRNA表达变化研究目的及意义利用基因表达谱芯片检测醛固酮瘤和正常肾上腺组织中全基因组基因的差异表达,结合醛固酮合成路径相关酶与调节因子基因的表达改变,探讨醛固酮瘤中醛固酮高分泌的可能原因及机制。研究方法1.所取6例醛固酮瘤和6例正常肾上腺组织,均经临床表现和术后病理证实,采用HumanRef-6v2芯片,分别检测比较两组标本全基因组基因的mRNA表达差异。2.采用Matlab和Graphviz软件对所得数据进行生物信息学分析,包括差异表达基因的筛选,基因功能的富集分析,信号转导通路的富集分析,构建基因的功能关联网络。研究结果根据FC≥2为表达增高或降低的标准,P≤0.01为具有统计学差异,APA组有852个差异表达基因,其中529个表达上调,323个表达下调。按功能主要分为：细胞连接粘附相关基因46个；细胞因子-细胞因子受体相互作用相关基因41个；促分裂原活化蛋白激酶信号通路相关基因40个；钙信号通道相关基因27个；肌动蛋白细胞骨架调节相关基因27个；轴突导向相关基因25个；细胞分子粘附相关基因23个；神经配体-受体相互作用相关基因23个。结合文献报道对醛固酮调节起重要作用,且与我们芯片结果一致的基因进行筛选,共选出上调基因7个,下调基因3个,用于课题第四部分的研究。上调的基因分别为：CYP11B2、KCNJ5、HTR4、TDGF1、PCP4、VPREB3和STAR;下调的基因分别为：AKR1C3、CYB5A和CYP17Al。研究结论1、醛固酮瘤组上调基因主要涉及到的显著性功能是：经G蛋白偶联受体信号通路,加快蛋白质的去磷酸化,蛋白质的转运,机体对刺激作出响应,集中加强细胞粘附,加大胞吞作用以及加强机体的免疫反应。而下调基因涉及到的显著性功能主要是：减弱氧的运输,调节NF-kappaB的向核转移,调控细胞周期及细胞凋亡,抑制细胞分化。2、通过GO分析提示醛固酮瘤与正常肾上腺组织基因在生物学过程中的差异主要表现在信号转导、DNA依赖的转录调控和细胞粘附方面；在细胞组成方面的差异主要表现在细胞膜的完整、胞核和细胞质,这与课题第一部分醛固酮瘤电镜下的表现相一致；在分子功能方面的差异主要表现在蛋白结合和金属离子的结合。3、参与醛固酮合成的酶中,CYP11B2基因表达升高；生理情况下大多数调节醛固酮合成的因子均下调,仅RENBP和NR1H2上调,提示肿瘤有独特的促进醛固酮合成路径。第三部分醛固酮瘤LncRNA表达变化研究目的及意义利用基因芯片技术和RT-PCR技术,研究与正常肾上腺组织相比,醛固酮瘤组织差异表达lncRNA情况,探讨醛固酮瘤发生发展过程中可能参与调控作用的lncRNA的情况,更加深入探讨醛固酮瘤发生、发展和高分泌状态的可能机制,为进一步研究肿瘤标记物和药物作用靶点提供理论基础和实验证据。研究方法1、选取6例经病史、临床表现、生化检查、影像学检查和术后病理检查,明确诊断为肾上腺醛固酮瘤病例作为实验组,另选取肾癌根治术切取的肾上腺,经病理证实为正常肾上腺组织的6例病例作为对照组。入选的12例标本每例分为三份,一份用多聚甲醛固定,行HE病理染色,一份用2.5%电镜级戊二醛固定,行电镜检查,一份在手术切下标本后即刻放入液氮中冷冻、保存。6对标本分别行Microarry基因芯片检测,进行差异基因筛选和RT-PCR验证,确定筛选lncRNA的准确性。2、Trizol(Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA)等提取组织块中的总RNA。并进一步采用NucleoSpin(?)RNAclean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)对总RNA进行过柱纯化,最后用分光光度计定量,甲醛变性胶电泳质检。对样品RNA进行荧光标记(晶芯(?)cRNA扩增标记试剂盒)样品RNA。标记的DNA溶于杂交液中(2XGExHybBuffer(HI-RPM),25%甲酰胺),于45℃杂交过夜。杂交结束后,先在42℃左右含0.2%SDS,2×SSC的液体中洗5min,而后在0.2×SSC中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。芯片用AgilentG2565CAMicroarrayScanner进行扫描,得到杂交图片。芯片图像的采集和数据分析。对选取的LncRNA进行RT-PCR验证。3、统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。各实验组数据均以(X±S)表示,试验数据均重复3次。满足正态分布且方差齐同的两组间lncRNA表达差异的比较,采用两组独立样本的t检验,不满足正态分布时采用非参数检验。所有检验均以双侧P≤0.05为差异有统计学意义。结果1、lncRNA芯片表达谱结果在醛固酮瘤组织中lncRNA均上调或下调表达倍数在2倍以上且三次生物学重复P≤0.01的lncRNA有883个,其中上调表达的lncRNA有649个,下调表达的lncRNA有234个。选择与醛固酮合成有关的LncRNA进一步研究,其中上调的为LINC00290、RP11-460H9.1、LSAMP-AS2和RP11-457M11.5,下调的为RP11-525J21.1、RP11-998D10.4、AC128709.4、RP11-79P5.2和RP11-738B7.1。2、RT-PCR验证芯片结果RT-PCR定量检测LINC00290、RP11-460H9.1、LSAMP-AS2、RP11-457M11.5、RP11-525J21.1、RP11-998D10.4、AC128709.4、RP11-79P5.2和RP11-738B7.1的差异表达变化趋势与芯片结果完全一致。结论1、醛固酮瘤lncRNA表达谱改变显著,提示lncRNA可能参与了肾上腺醛固酮瘤的发生发展过程。2、筛选出醛固酮瘤差异表达的lncRNA:LINC00290、RP11-460H9.1、LSAMP-AS2、RP11-457M11.5、RP11-525J21.1、RP11-998D10.4、AC128709.4、RP11-79P5.2和RP11-738B7.1提示它们可能是醛固酮瘤的发生发展过程中起重要调控作用的因子,今后有可能成为醛固酮瘤诊断或鉴别诊断的特异性分子标记物；也有可能成为醛固酮瘤药物或分子治疗的新靶点。第四部分LncRNA与mRNA调控关系的研究研究目的及意义根据已有的研究资料,探讨醛固酮瘤表达谱中差异表达的lncRNA与差异表达的mRNA之间可能存在的调控关系,揭示LncRNA对醛固酮瘤发生、发展可能的调控机制,为进一步研究醛固酮瘤的发病机制提供实验依据。研究方法通过皮尔逊积矩相关系数生物信息学分析方法,构建lncRNA与nRNA共表达调控关系网图,预测lncRNA与mRNA之间相互作用关系。1、计算lncRNA与mRNA表达相关性,根据设定的域值筛选lncRNA与mRNA关系对,构建lncRNA与mRNA共表达网络。2、基于lncRNA与tnRNA表达相关性以及lncRNA与mRNA基因组位置近邻关系,得到lncRNA的潜在靶标基因,对存在共表达关系的lncRNA和其可能作用的靶标基因(mRNA)进行功能注释以预测其可能的调控模式。3、研究lncRNA与mRNA的共表达网络的拓扑学特性,基于度筛选网络拓扑上重要的lncRNA,这些lncRNA极有可能是与研究背景相关的lncRNA.研究结果1、ENST00000512487、ENST00000506917和ENST00000496217三个lncRNA之间相互调控,这三个lncRNA均不参与课题研究所选重要mRNA的调控；其中ENST00000496217和ENST00000512487、ENST00000506917之间呈负调控,ENST00000512487和ENST00000506917之间呈正调控。2、ENST00000547523与ENST00000514661呈负调控,而ENST00000547523不直接参与mRNA的调控。3、ENST00000514661、ENST00000445908和ENST00000497854的调控关系最为复杂,它们除了可以相互之间调控外,还可以调控ATR、CYB5A和AKR1C3的表达。4、HTR4不受LncRNA的调控,它只受KCNJ5的正调控。5、ENST00000547523可以正向调控CYB5A和AKR1C3的表达,可以负向调控PCP4的表达。6,ENST00000320322可以正向调控ENST00000445908和ENST00000497854,也可以正向调控AKR1C3的表达。7、CYP11B2的表达只受ENST00000497854的调控,并且ENST00000497854对CYP11B2的调控是正向调控。研究结论1、ENST00000512487、ENST00000506917和ENST00000496217三个lncRNA不参与课题研究所选重要mRNA的调控,所以不是本次实验研究重点内容。2、ENST00000547523不直接参与课题研究所选重要mRNA的调控,其作用方式是通过负向调控ENST00000514661从而间接调控ATR、CYB5A和AKR1C3的表达,此调控关系和调控过程复杂,不是本次实验研究重点内容。3、ENST00000514661、ENST00000445908和ENST00000497854的调控关系最为复杂,它们除了可以相互之间调控外,还可以调控ATR、CYB5A和AKR1C3的表达,不是本次实验研究重点内容。4、HTR4不受lncRNA的调控,它只受KCNJ5的正调控,不是本次实验研究重点内容。5、CYP11B2的表达只受lncRNALSAMP-AS2的调控,并且lncRNALSAMP-AS2对CYP11B2的调控是正向调控,是所有调控关系中最为简单的lncRNA调控mRNA的形式,是本次实验研究重点关注的内容。6、lncRNALSAMP-AS2调控CYP11B2的机制与经典的阿兹海默症调控机制相似,阿兹海默症调控也是通过反义链lncRNABACE1AS调控mRNABACE1,产生过量的β淀粉样蛋白从而出现阿兹海默症的表现。LSAMP-AS2基因反义链在细胞核内产生lncRNALSAMP-AS2,并通过核膜进入胞质,CYP11B2基因转录的mRNA在细胞核内完成加工过程,形成完整的CYP11B2mRNA,并通过核膜也进入胞质,在胞质中lncRNALSAMP-AS2与CYP11B2mRNA结合进入线粒体,这种lncRNALSAMP-AS2与CYP11B2mRNA结合体阻止CYP11B2mRNA被其他非编码小RNA降解,增加CYP11B2mRNA的稳定性,导致CYP11B2过量表达,从而在滑面内质网上大量翻译,产生过多的醛固酮。
【作者】张利朝；
【导师】胡卫列；
【作者基本信息】南方医科大学，泌尿外科（专业学位），2014，博士
【关键词】lncRNAmRNA；醛固酮瘤；实时定量PCR；电镜超微结构；微阵列分析；

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