尘螨变应原舌下免疫治疗对变应性鼻炎TSLP-OX40L信号通路介导的TH2型免疫反应的影响及其临床疗效观察

【摘要】研究背景WHO指出“变应性疾病是二十一世纪人类面临的三大健康问题之一”。变应性鼻炎又称过敏性鼻炎,是以鼻腔粘膜为主要的效应部位,以机体免疫系统异常为主要的病理基础,在特异性体质的患者接触变应原后引起的,以IgE介导的,嗜酸性粒细胞反应为主的,由多种炎症细胞及细胞因子共同参与的Ⅰ型变态反应性疾病。其共同特征即所谓的“TH2型免疫反应”。目前认为,有多种细胞共同参与到TH2(Ⅱ型辅助性T细胞,Thelpcell2)型免疫反应过程中,形成了一个复杂的免疫反应的网路系统。其中涉及了T细胞、B细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、抗原递呈细胞以及最新发现的先天辅助细胞群等。TH2型免疫应答的特点是诱导CD4+T细胞(分化群,clusteofdifferentiation)分化,其分泌的细胞因子包括：IL-4、EL-5、IL-9、IL-13(白细胞介素,interleukin)。TH2细胞通过分泌IL-4促进B细胞反应和IgE的分泌。当IgE免疫复合物结合到位于嗜碱细胞和肥大细胞表面的高亲和力的IgE受体(FceRl),导致上述细胞激活并释放多种细胞因子和炎症介质,包括：组织胺、肝素和血清素。这些细胞因子介导了一系列的以TH2型免疫反应为特点的效应功能。包括有选择的募集和活化巨噬细胞和粒细胞,引起平滑肌的收缩和粘液过量分泌。对这个复杂的免疫反应网路系统进行纵向的分析可见,整个TH2型免疫反应的过程大致包括4部分：机体免疫系统对变应原的识别、机体致敏、机体再次接触变应原后产生的TH2型免疫反应和机体免疫系统对TH2型免疫反应的记忆和免疫维持。而对这个免疫反应网路系统进行横向的比较就会发现,TH2型免疫反应主要涉及机体的粘膜免疫和系统免疫这两大免疫系统。同时还应看到,TH2型免疫反应本身也存在多样性,表现在启动TH2型免疫反应的刺激形式多样性、先天免疫系统感受刺激的机制多样性、调控免疫反应的细胞和分子通路多样性,甚至在Th2细胞免疫反应中应答的细胞因子也存在多样性。总之,虽然目前对TH2型免疫反应已经进行了大量的临床和实验研究,但是人们对TH2型反应如何启动、反应、维持及调控仍知之甚少。变应原特异性免疫治疗(allergenspecificimmunotherapy,SIT)的临床应用已经有一百多年的历史,它是目前唯一被认可的能够改变变应性疾病自然进程,针对病因的治疗方案。根据ARIA指南推荐,适用于持续性中重度变应性鼻炎患者。目前临床常用的免疫治疗包括：变应原皮下免疫治疗(subcutaneousimmunotherapy,SCIT)和变应原舌下免疫治疗(sublingualimmunotherapy,SLIT)。虽然已有大样本的随机双盲安慰剂对照的临床研究证实,SIT最终可明显改善变应性鼻炎患者相关的临床症状,减少对药物的依赖,但是SIT的作用机制仍存在许多未知。目前有关SIT作用机制的结论多是基于SCIT的研究结果。尘螨变应原SLIT应用于变应性鼻炎的临床治疗始于1986年,直到目前为止,人们对尘螨变应原SLIT涉及的许多问题仍然存在争议。这其中主要包括：临床疗效如何、作用机制是什么、尘螨变应原SLIT对机体免疫系统的影响是什么、与花粉变应原SLIT相比,尘螨SLIT的特点和规律是什么、免疫治疗的疗程需要多久、免疫维持所需的变应原的浓度是多少等诸多问题都仍然未知。目前,SLIT主要在欧洲地区的国家得到认可和较广泛的临床应用,其适用对象主要是间歇性变异性鼻炎的患者,即花粉症的患者。在已经发表的超过60项随机双盲安慰剂对照的SLIT中,花粉症患者约占SLIT总数的30%以上。因此目前SLIT相关的结论多是基于欧洲团队针对花粉症的研究结果。但是近年来随着对SLIT基础研究及临床应用研究的进展,SLIT凭借其所特有优势正逐步得到越来越多关注。近几年尘螨变应原SLIT的相关研究也逐步增多,多项最新的研究初步证实了尘螨变应原SLIT的临床疗效及安全性,临床疗效方面显示尘螨变应原SLIT能有效的缓解变应性鼻炎及哮喘的临床症状,减轻对药物的依赖,降低患者产生新的过敏原的危险。安全性方面,SLIT相对于SCIT更具有明显的优势,但是其中的很多细节仍不明确,而且仍有相反结论的研究报道。而有关尘螨变应原SLIT作用机制的最新研究认为：SLIT与SCIT的作用机制可能存在部分的重叠或者有相似的作用机制,由于作用途径及使用剂量的不同,因而存在的差异部分可能主要在对粘膜免疫的影响,而SLIT是否也能引起系统免疫显著的变化也没有明确的答案。有关变应性鼻炎免疫机制的最新研究发现了一种新的细胞类型,被称为“先天固有免疫细胞”(先天辅助细胞,innatehelpercell)。研究发现它们能通过直接产生TH2型免疫反应的细胞因子的方式介导TH2型免疫反应。其中TSLP-OX40L信号通路在TH2型免疫反应的启动及免疫维持发挥的重要作用正逐步受到重视。胸腺间质淋巴细胞生成素(Thymicstromallymphopoietin,TSLP)是一种IL-7样的Ⅰ型细胞因子,属于IL-2细胞因子家族成员之一,主要由作为粘膜屏障的上皮细胞在外界环境刺激下产生。有研究资料显示TSLP是TH2型免疫反应重要的启动因素,当作为机体屏障的粘膜部位受到变应原的刺激,粘膜内的上皮细胞产生大量的TSLP,TSLP能够通过极化人树突状细胞诱导naiveT细胞向TH2细胞分化,从而启动TH2型免疫反应。此外,TSLP能够诱导强烈的人类TH2记忆细胞的扩增,从而维持中央记忆细胞的表型和TH2细胞反应状态。OX40L为O型跨膜糖蛋白,属TNF家庭成员。OX40L由抗原递呈细胞(allergenpresentcell,APC)如B细胞、树突状细胞(dendriticcells,DCs)诱导表达,多种促进APC成熟的因素都能够促进OX40L的表达。在TSLP介导的TH2型免疫反应中,OX40L通过于OX40相互作用对于维持和重新激活TH2记忆细胞反应是非常重要的。TSLP通过极化人树突状细胞实现诱导naiveT细胞向TH2细胞分化,而这种功能又是通过介导树突状细胞表面的OX40L的表达的途径实现的。研究发现阻断OX40/OX40L的相互作用,能实现对TSLP诱导的炎症性TH2细胞或抗原特异性TH2记忆细胞的靶向抑制,为变应性疾病的临床治疗提供新的思路和方法。有关TSLP-OX40L介导的信号通路对DCs的作用和对T细胞的功能的影响已经在变应性疾病的研究中有大量的报道。最新的研究发现,记忆性TH2细胞是维持慢性变应性炎症反应和变应原再次暴露后引起的过敏性炎症反应再发的主细胞群,在特异性皮炎患者病变部位角蛋白细胞TSLP表达升高。这些都提示在变应性性疾病的病理生理过程中,TSLP和记忆性TH2细胞之间关系的重要性。上皮细胞表达的TSLP对启动和维持TH2细胞免疫反应的作用与其所具有的独特的DCs激活能力有密切的关系。此外研究发现,由TSLP激活的DCs表达的OX40L是TH2型免疫反应的重要的信号反应通路。TSLP-OX40L信号通路有可能成为应对变应性疾病的潜在的分子靶点。总之,对TSLP-OX40L信号通路进行阻断,从而实现对变应性疾病的治疗已经成为目前研究的热点。针对变应性疾病的传统药物治疗重要局限在TH12型免疫反应的效应阶段,包括激活的T细胞、肥大细胞和嗜酸细胞。在变应性免疫反应的启动阶段,以TSLP和或OX40L为治疗靶点的新概念的出现,为变应性疾病的治疗开辟了新的研究方向。由于SLIT具有借助粘膜途径对机体TH2型免疫反应进行调控的特点,而TSLP-OX40L信号通路介导的TH2型免疫反应也是以粘膜的应激反应为启动阶段,进而引起包括粘膜免疫和系统免疫在内的一系列的免疫级联反应,因此尘螨变应原SLIT与TSLP-OX40L介导的TH2型免疫反应之间是否存在相互影响及作用关系值得期待,这也是本研究拟探讨的主要问题,而目前尚无相关报道。研究目的探讨尘螨变应原SLIT治疗12个月对持续性中重度变应性鼻炎患者机体TSLP-OX40L信号通路介导的TH2免疫反应占优势的免疫状态的影响,包括鼻腔局部粘膜免疫反应的变化和机体系统免疫的变化。同时结合对患者临床症状的动态观察和评估,进一步分析尘螨变应原SLIT对机体TH2型免疫反应的影响和作用机制,为尘螨SLIT临床治疗和临床疗效评估及作用机制研究提供指导和帮助依据。研究方法’本研究以中国华南地区对尘螨过敏的持续性中重度变应性鼻炎患者为研究对象,以尘螨变应原舌下特异性免疫治疗为干预因素,以免疫治疗12个月为研究的时间截点,采取病例对照的研究方法,分别在免疫治疗开始前及免疫治疗12个月对机体TH2型免疫反应相关客观指标进行检测和分析,在此期间,同时对患者变应性鼻炎相关临床症状进行动态的观察和分析。首先,本研究项目总结了尘螨变应原SLIT治疗12个月内相关临床症状变化特点及规律；在此基础上,以TH2型免疫反应及变应原舌下特异性免疫治疗方面的最新的研究进展为依托,选取TSLP-OX40L信号通路为切入点,进一步分析患者鼻粘膜免疫和机体系统免疫相关免疫指标的变化情况。其中包括：酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测鼻腔灌洗液中IL-4、IL-13、干扰素-γ(Interferon-gama,INF-γ)及TSLP的表达；实时荧光定量PCR(Real-timeQuantitativePCR,RT-PCR)检测外周血中转录因子T-betmRNA(transcriptionfactorT-betmRNA,T-betmRNA)、转录因子GATA-3mRNA(transcriptionfactorGATA-3mRNA,GATA-3mRNA).及OX40LmRNA的表达；流式细胞检测外周血单个核细胞(peripheralbloodmonouclearcells,PBMC)中OX40L的表达和PBMC来源的DCs(CD11c+CD86+)表面OX40L的表达；免疫组化检测部分患者鼻粘膜TSLP的表达。从上述各项客观指标的变化情况反应TSLP-OX40L介导的TH2型免疫反应是否发生改变,包括反应局部鼻粘膜免疫的指标和反应机体系统免疫的指标。最后将临床观测结果与实验室检查的客观结果进行分析汇总,解释临床症状变化的理论依据,探讨尘螨变应原SLIT治疗持续性中重度变应性鼻炎的作用机制。研究结果(一)临床部分(第一章)：经过12个月的尘螨变应原SLIT,对46例持续性中重度变应性性鼻炎患者临床症状评分(包括鼻腔总体症状评分和鼻腔各个单项症状评分)和药物使用评分进行整体比较,结果都呈现明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。其中鼻腔总体症状评分由免疫治疗前9.065±1.162降至4.413±0.717(X2=82.667,P<0.001)；在鼻腔单项症状评分之中,鼻痒症状评分由免疫治疗前2.391±0.493降至1.022±0.257(X2=86.681,P<0.001)；鼻塞症状评分由免疫治疗前2.000±0.633降至1.196±0.401(X2=60.057,P<0.001)；打喷嚏症状评分由免疫治疗前2.457±0.504降至1.109±0.315(X2=74.146,P<0.001)；流鼻涕症状评分由免疫治疗前2.217±0.417降至1.087±0.354(X2=83.532,P<0.001)。药物使用评分由治疗前2.870±0.341降至1.109±0.315(X2=79.590,P<0.001)。结果显示尘螨变应原SLIT治疗12个月,持续性中重度变应性鼻炎患者临床症状显著改善,患者对药物的依赖明显降低。治疗期间无严重的不良事件的发生,无症状加重的病例报告。动态观察临床症状变化发现,鼻腔总体症状评分在尘螨变应原SLIT治疗12个月内总体呈现逐步的下降趋势。其中免疫治疗1个月,鼻腔总体症状的评分由免疫治疗前9.065±1.162降至7.132±1.554,差异有统计学意义(Z=-5.264,P<0.001)。在免疫治疗前6个月,患者鼻腔总体症状评分的降幅较大,下降趋势明显,呈陡降型变化曲线,由免疫治疗前9.065±1.162降至4.935±1.063,差异有统计学意义(Z=-5.962,P<0.001)。而从免疫治疗6个月至免疫治疗12个月期间,鼻腔总体症状评分降幅不明显,呈现平台型变化曲线,变化差异无统计学意义(Z=-2.449,P=0.014>0.0125)(此处需调整检验水准,以P<0.0125为差异有统计学意义)。至免疫治疗12个月,患者鼻腔总体评分大约为治疗前的50%左右。鼻腔单项症状评分的变化趋势与鼻腔总体症状评分的变化趋势基本一致。只有鼻塞症状评分和药物使用评分在免疫治疗6个月与免疫治疗12个月比较时显示有统计学差异(P<0.0125)(检验水准需调整,以P<0.0125为差异有统计学意义)。此外在研究中还发现,部分患者(13.04%,6/46)在鼻腔总体症状评分逐步下降的过程中出现评分的一过性反弹,呈现波浪状的下降趋势,但其症状反弹时的鼻腔总体症状评分始终低于治疗前的评分,反弹发生的时间在免疫治疗后3-7个月内。(二)实验部分(第二章、第三章)：HE染色(第二章)：采用HE染色对鼻分泌物涂片中嗜酸性粒细胞计数在尘螨变应原SLIT开始前、免疫治疗6个月和免疫治疗12个月三个时间点进行整体比较,结果显示差异有统计学意义(Cochran’sQ=23.330,P<0.001).其后分别将三个时间点鼻分泌物嗜酸性粒细胞计数分别进行两两比较发现(此处需调整检验水准,以P<0.0125为差异有统计学意义)：免疫治疗后鼻分泌物嗜酸性粒细胞计数较免疫治疗前显著下降,差异有统计学意义(免疫治疗6个月：Z=-3.162,P<0.0125；免疫治疗12个月：Z=-3.873,P<0.001)；免疫治疗6个月与免疫治疗12个月相比,差异无统计学意义(Z=-2.236,P>0.0125)。ELISA检测(第二章、第三章)：鼻腔灌洗液中的细胞因子IL-4、IL-13、INF-y及TSLP在尘螨SLIT治疗12个月后都显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。其中IL-4由76.010±9.394(pg/ml)降至32.910±8.752(pg/ml)(t=27.010,P<0.05);IL-13由55.680±12.860(pg/ml)降至30.000±9.453(pg/ml)(t=14.050,P<0.05);INF-γ由30.600±6.755(pg/ml)降至21.710±5.457(pg/ml)(1=8.087,P<0.05);TSLP由36.390±6.610(pg/ml)降至21.780±4.231(pg/ml)(t=11.110,P<0.05)。此外,IL-4/INF-γ比值也显著下降,由治疗前2.584±0.581降至治疗后1.611±0.593,差异有统计学意义(t=8.987,P<0.05)。血清TIgE和sIgE(第二章)：在尘螨SLIT治疗12个月前后的表达分别为：TIgE治疗前为423.900±29.990(kU/L),治疗后为420.200±39.110(kU/L);sIgE治疗前为54.920±5.217(kU/L),治疗后56.790±6.750(kU/L),差异无统计学意义(P>0.05)。QRT-PCR检测(第三章)：外周血中,T-betmRNA表达在SLIT治疗12个月后显著升高,由治疗前3.458±0.620,提高至治疗后5.389±1.228差异有统计学意义(t=12.230,P<0.05);GATA-3mRNA表达显著降低,治疗前为12.440±2.536,治疗后为7.246±1.953,差异有统计学意义(t=11.920,P<0.05);T-betmRNA/GATA-3mRNA的比值显著升高,治疗前为0.288±0.071,治疗后为0.785±0.251差异有统计学意义(t=13.890,P<0.05);OX40LmRNA的表达在SLIT治疗12个月后显著下降,由治疗前1.401±0.361,下降至治疗后0.772±0.301,差异有统计学意义(t=12.300,P<0.05)；外周血OX40LmRNA表达水平与T-betmRNA/GATA-3mRNA比率相关性分析显示,免疫治疗12个月前后,OX40LmRNA表达水平与T-betmRNA/GATA-3mRNA的比率都呈负相关,差异有统计学意义(免疫治疗前：r=-0.440,P<0.05；免疫治疗12个月后：r=-0.565,P<0.05)；外周血OX40LmRNA表达水平与鼻腔灌洗液TSLP表达水平相关性分析显示,免疫治疗12个月前后,OX40LmRNA表达水平与TSLP表达水平呈正相关(免疫治疗前：r=0.491,P<0.05；免疫治疗12个月后：r=0.548,P<0.05),差异有统计学意义。流式细胞检测(第三章)：外周血单个核细胞表面OX40L的表达在SLIT治疗12个月后显著下降,由免疫治疗前(2.712±0.511)%,下降至免疫治疗12个月后(1.630±0.471)%,差异有统计学意义(t=13.100,P<0.05)；外周血单个核细胞来源的DCs(CD11c+CD86+)表面OX40L的表达也显著下降,由免疫治疗前(5.839±2.841)%,下降至免疫治疗12个月后(2.098±0.870)%,差异有统计学意义(t=9.946,P<0.05)。免疫组化检测(第三章)：本研究中有6例患者在免疫治疗前和免疫治疗12个月后接受了鼻粘膜HE染色和TSLP免疫组化染色。研究发现在SLIT治疗前鼻粘膜HE染色见：鼻粘膜上皮细胞之间的间隙宽,部分上皮细胞层变薄,上皮层下大量嗜酸性粒细胞浸润；TSLP染色见：上皮细胞TSLP表达阳性染色比例为83.33%,镜下见多数上皮细胞胞浆内大量粗大的棕黄色颗粒染色。SLIT治疗12个月后,鼻粘膜HE染色：上皮细胞间排列较前紧密,上皮层下嗜酸性粒细胞浸润减少,部分上皮层变薄未见明显改善；TSLP染色见：上皮细胞TSLP表达阳性33.33%,上皮细胞胞浆内棕黄色染色颗粒变小,颜色变浅。研究结论1.尘螨变应原SLIT治疗12个月,对于持续性中重度变应性鼻炎具有显著的临床疗效和安全性。其鼻腔总体症状约为免疫治疗前的50%左右。2.尘螨变应原SLIT治疗12个月期间,患者临床症状的缓解呈现逐步改善的趋势。其中免疫治疗前6个月,临床症状改善幅度大,呈现陡降型临床症状变化曲线；免疫治疗后6个月,临床症状相对稳定,变化不大呈现平台型临床症状变化曲线。部分患者(13.04%)在免疫治疗的前6个月左右,临床症状会出现一定程度的反弹,总体呈现为波浪状下降的临床症状变化曲线。3.尘螨变应原SLIT治疗早期(免疫治疗开始后1个月)即可产生显著的临床疗效,该结果早于本研究对临床疗效起效时间的预期。4.尘螨变应原SLIT治疗12个月,持续性中重度变应性鼻炎患者鼻粘膜免疫的TH2型免疫反应占优势的免疫状态得到下调,表现为鼻粘膜局部TH2型免疫反应强度的下调,TH1/TH2免疫反应之间的平衡状态向TH1反向偏倚。5.尘螨变应原SLIT治疗12个月,持续性中重度变应性鼻炎患者机体的系统免疫中TH2型免疫反应占优势的免疫状态实现下调,表现为调控TH2型免疫维持或免疫记忆功能的OX40L表达水平的下调,TH1/TH2免疫反应之间的平衡状态向TH1反向偏倚。6.尘螨变应原SLIT治疗12个月,能实现对持续性中重度变应性鼻炎患者粘膜免疫和系统免疫中TH2型免疫反应占优势的免疫状态的下调。7.尘螨变应原SLIT治疗12个月,持续性中重度变应性鼻炎患者临床症状显著改善,机体OX4OL和粘膜TSLP表达水平的下调,结合TH2型免疫反应在粘膜免疫和系统免疫的下调和TH1/TH2免疫平衡向TH1方向偏倚,提示着患者机体TSLP-OX40L信号通路介导的TH2型免疫反应的下调。8.尘螨变应原SLIT的临床疗效能在免疫治疗早期的实现,来源于鼻腔粘膜免疫中TH2型免疫反应下调的结果；而免疫治疗后期,临床疗效的相对稳定源于系统免疫中维持TH2型免疫记忆的OX40L下调的结果。9.对于持续性中重度变应性鼻炎患者,尘螨变应原SLIT治疗后鼻粘膜TSLP表达下调可以作为预测患者系统免疫中TH2型免疫反应下调的指标。
【作者】孟庆翔；
【导师】梁勇；
【作者基本信息】南方医科大学，耳鼻咽喉科学（专业学位），2014，博士
【关键词】变应性鼻炎；免疫治疗；TSLP；OX40L；

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