黄芪多糖对人红白血病K562细胞增殖和凋亡的影响及机制

【摘要】背景与目的积极探索白血病新的治疗策略正日益受到关注白血病(leukemia)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。白血病细胞起源于造血干细胞,其细胞的生长特点是增殖失控、凋亡受阻及分化障碍。另外,白血病细胞充斥于人体的循环系统、造血器官及被侵犯的组织,这有别于实体瘤,其治疗方法受到很大的限制。因此,发掘能够抑制白血病细胞增殖、诱导白血病细胞凋亡、促进白血病细胞分化成熟的中药及其有效成分,并运用现代分子生物学技术探讨其作用机制已成为极具活力的重大课题之一。中药的抗肿瘤作用化疗药物的临床应用受到了毒副作用、耐药性等的限制。近年来,研究者们已经发掘出一些具有抗肿瘤活性的中药,且具有毒副作用较少、患者易于接受等优点。但是,中药抗肿瘤作用的机制仍是困扰研究者们的一个重大难题。黄芪多糖的活性成分、生物学活性和抗肿瘤作用黄芪为豆科植物属蒙古黄芪、膜荚黄芪的干燥根。黄芪的主要成分包括黄芪皂苷、黄芪多糖(AstragalusPolydsaccharide,APS)、氨基酸、微量元素和钙等。APS是黄芪的主要活性成分,是黄芪中含量最多、药理作用最强的一类物质。APS具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗应激、抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效。值得注意的是,APS的抗肿瘤作用已被越来越多的研究证实；研究发现,APS在体内外对肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌和S180肉瘤等恶性肿瘤有明显的抑制作用。黄芪多糖的抗肿瘤作用机制及缺陷对于APS抗肿瘤作用的机制研究,主要集中在其增强机体免疫功能方面,如：APS能够促进白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-αmTNF-α)等细胞因子表达,能够增强树突状细胞(dendriticcell,DC)、巨噬细胞和自然杀伤细胞的吞噬能力。另外,研究还发现,APS能够通过影响端粒酶活性、血管生成等抑制肿瘤的生长。但是,运用现代分子生物学技术从分子水平探讨APS抗肿瘤作用机制仍需要深入研究。许杜娟等以小鼠实体型肿瘤模型和肝癌细胞株为研究对象的研究发现,黄芪总提取物明显抑制小鼠实体型肿瘤的生长,并可引起肝癌细胞系发生凋亡；而刘兵荣等研究却发现,黄芪多糖可能通过抑制核因子NF-κB表达来抑制大鼠脑出血后的细胞凋亡。提示APS与细胞凋亡的关系及相关机制值得进一步深入研究。研究内容、研究假设和目的意义本课题组成功提取了APS,拟在此基础上通过不同方法从不同角度进一步研究APS是否能够抑制人红白血病K562细胞增殖及其是否能诱导K562细胞凋亡。并进一步采用分子生物学技术探讨APS抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的分子机制。以期为APS用于白血病的治疗提供科学依据。方法1细胞株人红白血病K562细胞购自中科院上海细胞库。2APS对人红白血病K562细胞增殖的影响通过四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetra-zolium,MTT)法绘制生长曲线观察生长速度和倍增时间变化,通过流式细胞术检测细胞周期分布,以探讨APS是否能够抑制人红白血病K562细胞的增殖。3APS抑制K562细胞增殖的分子机制提取细胞总RNA和总蛋白并定量后,通过逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和Westernblotting等方法检测细胞周期蛋白A(CyclinA)、细胞周期蛋白B(CyclinB)、细胞周期蛋白E(CyclinE)和p21基因在mRNA和蛋白水平的表达。4APS对人红白血病K562细胞凋亡的影响通过AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞术、Caspase-3活性测定等方法研究APS是否能够诱导K562细胞凋亡。5APS诱导K562细胞凋亡的分子机制提取细胞总RNA和总蛋白并定量后,通过RT-PCR和Westernblotting等方法检测B细胞淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)、超大B细胞淋巴细胞瘤(B-celllymphoma-extralarge,Bc1-XL)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associatedXprotein,Bax)、凋亡抑制蛋白-1(inhibitorofapoptosisprotein-1,IAP-1)和第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活剂(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,Smac)基因在mRNA和蛋白水平的表达。6统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(i±s)表示。两个样本均数的比较采用t检验。多个样本均数的比较采用单向方差分析(one-wayANOVA),方差齐时多重比较采用LSD方法检验,方差不齐时方差分析采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett’sT3方法检验。检验水准为=α0.05。结果1APS的提取和定量提取APS后,根据标准曲线计算出APS的浓度为49.340mg/mL。2APS对人红白血病K562细胞增殖的影响通过MTT比色法绘制细胞生长曲线并计算倍增时间,结果显示：与对照组K562细胞(0μg/mLAPS)相比,100μg/mL、200μg/mL和400μg/mLAPS处理的K562细胞生长速度均明显减慢(P<0.01),倍增时间显著延长(P<0.01),并且呈现浓度依赖性。从上述实验结果可以看出100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的APS均能显著抑制K562细胞的生长速度并延长其倍增时间,结合实验中观察到的细胞状态,后续实验中均以200μg/mL的APS诱导48h的K562细胞为实验组,以不加药的K562细胞为对照组。流式细胞术检测周期分布结果显示：与对照组相比,实验组G1期细胞显著增多(P<0.01),而S期和G2/M期细胞显著减少(P<0.01)。3APS抑制K562细胞增殖的分子机制RT-PCR和Westernblotting结果显示：与对照组相比,实验组K562细胞中cyclinB和cyclinE在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(P<0.01),而p21在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著增加(P<0.01),cyclinA在mRNA水平和蛋白水平的表达差异均无显著性(P>0.05)。4APS对人红白血病K562细胞凋亡的影响AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：实验组K562细胞凋亡均数显著高于对照组K562细胞(P<0.01),对照组和实验组凋亡细胞百分比分别为：1.010%和32.966%。Caspase-3活性检测结果显示：与对照组相比,实验组K562细胞中Caspase-3活性显著增加(P<0.01)。5APS抑制K562细胞凋亡的分子机制RT-PCR和Westernblotting结果显示：与对照组相比,实验组K562细胞中Bcl-2和IAP-1在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(P<0.01),而Bax和Smac在mRNA水平和蛋白水平表达均显著增加(P<0.01),Bcl-XL在mRNA水平和蛋白水平的表达差异均无显著性(P>0.05)。结论1证实了APS能够显著抑制人红白血病K562细胞的增殖能力。2首次证实了APS可能是通过下调CyclinB和CyclinE以及上调p21的表达而抑制K562细胞的增殖能力,其该作用可能与CyclinA没有明显关系。3证实了APS能够诱导人红白血病K562细胞发生凋亡。4首次证实了APS可能是通过下调Bcl-2和IAP-1以及上调Bax和Smac的表达而诱导K562细胞发生凋亡,其该作用可能与Bc1-XL没有明显关系。
【作者】李超；
【导师】钱新华；千新来；
【作者基本信息】南方医科大学，儿科学（专业学位），2014，博士
【关键词】白血病；黄芪多糖；增殖；凋亡；细胞周期蛋白；p21；凋亡相关基因；

【参考文献】
[1]肖孟景.自噬在深二度烧伤创面早期加深中的表达及作用[D].中国人民解放军医学院,烧伤外科学,2013,硕士.
[2]杨岸渊.独立分量分析在气体检测中的应用[D].西安科技大学,控制工程,2013,硕士.
[3]邓秀华.数据仓库技术在超市销售管理中的应用[J].现代电子技术,2005,18:23-25.
[4]刘磊.小麦植株建模方法研究和脱粒过程仿真软件研制[D].吉林大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[5]徐凯琪,林明翔,唐代春,孙洋,闫勇,陈彬,王昊,贲留斌,刘燕燕,黄学杰.锂电池百篇论文点评(2014.4.1—2014.5.31)[J].储能科学与技术,2014,04:364-375.
[6]兰小蒙.马克思恩格斯的真理观[D].西北大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[7]刘婷婷.实时定量PCR法分析2型糖尿病患者肠道乳酸杆菌菌种数量的改变[D].南方医科大学,内分泌与代谢病学,2012,硕士.
[8]孙莉莉.“每”“各”和“every”“each”的比较研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[9]李郑杰.漳江口红树林区互花米草入侵及扩散机制研究[D].厦门大学,水生生物学,2014,硕士.
[10]金瑜辉.注射成型制备5CrMnMo基ZrO_2凃层的研究[D].哈尔滨工业大学,材料工程,2014,硕士.
[11]戴琦.基于ARM7TDMI和uClinux的嵌入式MPEG4网络视频终端[D].浙江大学,2005.
[12]魏冰.高中语文外国文学作品的选编与教学初探[D].杭州师范大学,课程与教学论,2005,硕士.
[13]吴佳鹏.平安投连保险危机原因及对策研究[D].大连理工大学,工商管理,2004,硕士.
[14]崔永丽.锂离子电池正极材料LiMn_2O_4的制备及其电极界面特性研究[D].中国矿业大学,2011.
[15]严加林.紫茎泽兰褐斑病的诊断鉴定及病原菌的主要生物学特性研究[D].西南大学,植物病理学,2014,硕士.
[16]杜晓丽,王俊丽,蒋昌俊.异构环境下基干松弛标记法的任务调度[J].自动化学报,2007,06:615-621.
[17]周超凡.风电场电能质量分析研究和仿真计算[D].华中科技大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[18]李志.可编程序控制器(PC)的特点应用范围与发展趋势[J].机械与电子.1986(06)
[19]陈亮.印制电路软硬结合板的电镀条件及附属流程设计软件开发[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[20]田博.碳纳米管互连线串扰问题的研究[D].天津理工大学,2012.
[21]郭洁卿.基于心理资本的河北省动漫企业技术创新研究[D].石家庄经济学院,企业管理,2013,硕士.
[22]冯硕.FOXC2在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[D].吉林大学,妇产科学,2014,硕士.
[23]李虹,蔡之华.关联规则在医疗数据分析中的应用[J].微机发展,2003,06:94-97.
[24]杜海宾.功率因数校正技术的研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[25]高泽生.铝钛硼生产中形成的副产品——氟铝酸钾的有效利用[J].轻金属.1992(06)
[26]王一峰.我国货物与服务出口贸易对国内就业贡献的比较研究[D].山东财经大学,国际商务（专业学位）,2014,硕士.
[27]刘川.基于手机摄像头扫描的QR码识别算法研究[D].重庆大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[28]张娥.融资性担保公司监管制度研究[D].安徽大学,经济法学,2014,硕士.
[29]姚从光.洋务运动代表人物的档案思想研究[D].山东大学,档案学,2013,硕士.
[30]徐雷,戴振宏,隋鹏飞,王伟田,孙玉明.双空位掺杂氟化石墨烯的电子性质和磁性[J].物理学报,2014,18:382-388.
[31]申建红,曾波,类淑桐,苏晓磊,黄文军.三峡水库消落区4种一年生植物种子的水淹耐受性及水淹对其种子萌发的影响[J].植物生态学报,2011,03:237-246.
[32]韩康.杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白IFT88基因的克隆及功能分析[D].郑州大学,细胞生物学,2013,硕士.
[33]南宁.喷雾闪速热分解法制备LiCoPO_4工艺研究[D].兰州理工大学,有色金属冶金,2014,硕士.
[34]左红艳.噪声习服对听觉损伤的保护作用及其机制探讨[D].中国人民解放军军事医学科学院,劳动卫生与环境卫生学,2004,硕士.
[35]朱姝民.从武威出土文物看西夏时期的凉州佛教[D].兰州大学,考古学及博物馆学,2013,硕士.
[36]陈丹.谷胱甘肽S-转移酶pi调控血管平滑肌细胞增殖和迁移的分子机制研究[D].南京大学,生物学,2014,博士.
[37]陈柏林.小交会角下双目视觉的测量方法研究[D].国防科学技术大学,航空宇航科学与技术,2012,硕士.
[38]齐维贵,丁宝.介绍一种根轨迹法设计软件[J].冶金自动化,1992,06:42-45+15.
[39]吴基诚.试析克里斯塔·沃尔夫的《对克里斯塔·T的思考》和《模式化童年》中的元小说性[D].广东外语外贸大学,德语语言文学,2013,硕士.
[40]侯国天.大学生村官综合信息管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[41]惠全景.自然边界元和区域分解法在一些非线性问题中的应用[D].上海大学,计算数学,2013,硕士.
[42]王鑫.无线传感器网络三维节点定位优化算法研究[D].厦门大学,控制工程,2014,硕士.
[43]张婷婷,张东,邱达.三维层状介质中基于走时梯度的多次波射线追踪[J].石油地球物理勘探,2014,06:1097-1105+3.
[44]洁米（MohamedbirhanJemilaJemal）.冲突映射和解决战略：南北苏丹关于阿布耶一地区争端研究[D].吉林大学,国际关系,2014,硕士.
[45]张勇军,何安瑞,郭强.冶金工业轧制自动化主要技术现状与发展方向[J].冶金自动化.
[46]赵琼.地方政府性债务现状及审计监督研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[47]林衍森.益肾降糖饮治疗气阴两虚兼血瘀证2型糖尿病肾病及对L-FABP、MDA影响的临床研究[D].福建中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[48]樊宇耕.256层螺旋CT脑血流灌注成像在动脉瘤性蛛网膜下腔出血后的应用研究[D].延安大学,外科学,2014,硕士.
[49]杨金霞.我国民事诉讼管辖权异议制度论[D].山东大学,诉讼法学,2013,硕士.
[50]刘思杭.80后公务员激励问题研究[D].郑州大学,行政管理,2013,硕士.