内脏脂肪素激活MAPKs通路参与动脉粥样硬化形成及小檗碱的干预研究
【摘要】背景：动脉粥样硬化((?)therosclerosis,AS)是对人类健康产生严重危害的疾病。由AS引起的心脑血管疾病发病率及死亡率现已居全球首位。随着社会与经济的发展,近年来AS在我国引起的心脑血管疾病发病率与死亡率也逐年增加。AS的形成原因非常复杂,其发病机制至今尚未完全明确。慢性炎症反应在AS的形成和发展过程中起到了关键作用,抗炎治疗是防治AS的重要策略。内脏脂肪素(visfatin)是一种新发现的脂肪细胞因子,临床研究发现AS患者血清visfatin显著升高,且常伴有炎症因子表达的增多。因此,我们推测visfatin可能作为一种促炎因子参与了AS的炎症反应过程。丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs)信号通路存在于大多数细胞内,其中主要有p38分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-jun-N-terminalkinase,JNK)和细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase,ERK)三条途径。JNK通路和p38MAPK通路主要对炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行转导,而ERK通路主要对细胞的生长、分裂和分化信号进行转导,研究表明p38MAPK、ERK和JNK三种通路均参与了AS的病理过程。我们推测visfatin促炎反应的机制可能与调控MAKPs信号通路有关。中医学无“冠状动脉粥样硬化”病名,一般认为其属于中医学“胸痹”、“中风”、“心痛”等范畴,病因多与“虚”、“瘀”、“痰”、“痰瘀”、“毒”等有关,病机多属于本虚标实,虚实夹杂。现代医学目前对于AS的治疗通常以他汀类药物为主,但长期使用此类药物可产生肝毒性、肌病、神经毒性、胃肠道反应等副作用,制约了其在临床的广泛使用。中药复方定心方是导师贾钰华教授研制的治疗心血管疾病的经验方,经过多年的临床和实验研究证明,定心方具有抗心肌缺血及再灌注损伤、抗心律失常、抗AS等作用,其主要成分之一中药黄连具有清热解毒的功效,同时具有多重心血管效应,黄连的有效提取物小檗碱治疗AS疗效显著,可通过调节血脂、抑制氧化应激、减少细胞凋亡、调节细胞能量代谢、抑制E-选择蛋白、炎症因子的表达及提高脂联素水平等多方面来发挥抗AS的作用,但其抗AS作用机制是否通过调节与炎症有关的脂肪细胞因子visfatin的表达尚缺乏更深入的研究。我们推测小檗碱可能通过调控visfatin的表达,从而发挥抗AS的作用,此作用机制可能与调控MAKPs信号通路有关。载脂蛋白E基因敲除(ApoEknockout,ApoE-/-)小鼠因其可产生泡沫细胞的堆积和血浆胆固醇的显著增高等自发性损伤,已成为AS研究领域应用最多的动物模型。血管内皮细胞损伤处于AS发生、发展过程中的早期阶段,保护血管内皮免受各种炎症因子的侵害,是抗AS发生、发展的关键。人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)在生物学特性的很多方面与动脉内皮细胞特征很相似,在疾病与血管功能尤其是AS的病理生理及形成机制研究中受到广泛的重视。本研究拟应用ApoE-/-小鼠加上高脂饲料喂养的方法制作AS动物模型,应用HUVEC作为细胞模型,分别从体内和体外两个方面研究visfatin在AS中的促炎症作用,应用MAPKs信号通路特异性抑制剂探讨其促炎症反应具体机制,并研究小檗碱对visfatin促炎症反应的干预作用及其机制,为中医药防治AS寻找新的靶点。目的：1.建立AS动物模型,研究visfatin在AS小鼠血清和主动脉组织中的表达情况及小檗碱的干预作用；2.研究AS小鼠血清脂质、血浆白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-a(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)含量及小檗碱的干预作用；3.研究小鼠主动脉AS斑块形态学测定,并检测AS斑块内visfatin表达,探讨小檗碱的干预作用。4.研究visfatin是否能诱导HUVEC分泌炎症因子IL-6、TNF-α,及其促炎症作用是否受p38MAPK、ERK和JNK信号通路的调节。5.研究小檗碱在visfatin诱导HUVEC分泌炎症因子IL-6、TNF-α过程中的干预作用及其机制是否受p38MAPK、ERK和JNK信号通路的调节。方法：1.动物部分50只8周龄雄性ApoE-/-小鼠,随机分为5组,每组10只,分别为：①模型组、②小檗碱低剂量组、③小檗碱中剂量组、④小檗碱高剂量组、⑤辛伐他汀组,均予高脂饲料喂养；以10只8周龄雄性C57BL/6J小鼠作为⑥对照组,予普通饲料喂养。②、③、④组分别给予小檗碱2.5、5、7.5mg/kg腹腔注射,每日一次；⑤组给予辛伐他汀药液灌胃5mg/kg,每日一次；①、⑥组灌服等剂量生理盐水,每周测体重一次,实验为期16周。腹腔麻醉小鼠,眼球摘除法采血。行心脏灌注,自小鼠主动脉根部至腹主动脉末端部分离整条主动脉,部分主动脉组织用4%多聚甲醛中固定,其余放入液氮中保存。主动脉组织行石蜡包埋、切片、髓染色观察小鼠主动脉组织病理形态学改变,比较各组斑块面积百分比；免疫组化法检测小鼠主动脉AS斑块visfatin的表达；分离血清及血浆,测血清甘油三脂(triglycerides,TG)、总胆固醇(totalcholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoprotein-cholesterol,HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoprotein-cholesterol,LDL-C)含量；ELISA法检测血清visfatin含量及血浆IL-6、TNF-α含量；主动脉组织提取蛋白,westernblotting测小鼠主动脉visfatin的表达。用SPSS13.0软件对实验结果进行数据统计学分析,P<0.05为具有统计学意义。2.细胞部分HUVEC分成以下各组：Visfatin浓度梯度组：分别以0、50、100、200μg·L-1visfatin作用HUVEC24h。Visfatin时间梯度组：以100μg·L-1visfatin分别作用HUVEC0、6、12、24、48h。药物干预组：共分为7组：①对照组；②小檗碱组：加入50μmol·L-1小檗碱孵育24h;③visfatin+小檗碱组：加入50μmol·L-1小檗碱预孵育1h后再加入visfatin100μg·L-1刺激24h;④visfatin组：加入visfatin100μg·L-1刺激24h；⑤visfatin+PD98059组：加入PD98059(终浓度为20μmol·L-1)预处理细胞30min,再给予visfatin100μg·L-1刺激24h;⑥visfatin+SB203580组：加入SB203580(终浓度为20μmol·L-1)预处理细胞30min,再给予visfatin100μg·L-1刺激24h；⑦visfatin+SP600125组：加入SP600125(终浓度为10μmol·L-1)预处理细胞30min,再给予visfatin100μg·L-1刺激24h。MTT法检测visfatin对HUVEC增殖的影响及小檗碱的干预作用；收集各组HUVEC上清液,ELISA法测上清液中IL-6、TNF-α含量,研究visfatin诱导HUVEC分泌炎症因子的作用及小檗碱的干预作用；冰上裂解HUVEC、提取各组HUVEC蛋白,BCA法行蛋白样品定量,westernblotting法检测p38MAPK、ERK、JNK蛋白及其磷酸化蛋白的表达,研究visfatin诱导HUVEC炎症反应作用机制与p38MAPK、ERK、JNK三种炎症信号转导通路的关系,及小檗碱的抗AS作用机制是否通过调节p38MAPK、ERK、JNK三种炎症信号转导通路抑制visfatin诱导HUVEC分泌炎症因子IL-6、TNF-α来实现。用SPSS13.0软件对实验结果进行数据统计学分析,P<0.05为具有统计学意义。结果：1.小鼠体重测量结果显示：各给药组体重增加值均显著低于模型组(P=0.00)；小檗碱高剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱低剂量组体重增加值与辛伐他汀组差异无统计学意义(P>0.05)；小檗碱高剂量组与小檗碱中剂量组、小檗碱低剂量组体重增加值无显著差异(P>0.05)。2.血脂检测结果：模型组血脂水平显著高于对照组(P<0.05),各给药组血清TG、TC、LDL-C水平均低于模型组,HDL-C高于模型组。与模型组相比,小檗碱高剂量组、辛伐他汀组血清TC、TG、LDL-C显著降低(P<0.05)。小檗碱高剂量组血脂水平低于小檗碱低、中剂量组,其中TG水平降低尤为明显(P<0.05)。3.小鼠主动脉AS斑块病变形态学观察：对照组未见AS病灶。模型组较辛伐他汀组、小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组AS斑块面积百分比显著增高(P=0.00)；小檗碱高剂量组AS斑块面积百分比显著低于小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组(P<0.05)；小檗碱低剂量组与小檗碱中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；小檗碱高剂量组与辛伐他汀组差异无统计学意义(P>0.05)。4小鼠主动脉AS斑块visfatin的表达：各给药组visfatin表达较模型组均显著升高(P<0.05)；小檗碱高剂量组与小檗碱中剂量组、小檗碱低剂量组visfatin表达均有显著差异(P<0.05)；小檗碱高剂量组与辛伐他汀组visfatin表达无显著差异(P>0.05)。5小鼠血清visfatin水平：辛伐他汀组、小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组小鼠血清visfatin水平较模型组显著降低(P=0.00)；小檗碱低剂量组小鼠血清visfatin水平较小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组显著增高(P<0.05)；小檗碱高剂量组小鼠血清visfatin水平与辛伐他汀组无显著差异(P>0.05)；小檗碱高剂量组小鼠血清visfatin水平与小檗碱中剂量组无显著差异(P=0.062)。6.小鼠主动脉visfatin蛋白的表达：各给药组小鼠主动脉visfatin蛋白表达显著低于模型组(P<0.05)；小檗碱低剂量组小鼠主动脉visfatin蛋白表达显著高于辛伐他汀组(P<0.00)；小檗碱高剂量组小鼠主动脉visfatin蛋白表达显著低于辛伐他汀组(P<0.00)；辛伐他汀组小鼠主动脉visfatin蛋白表达与小檗碱中剂量组无显著差异(P<0.166)。7.小鼠血浆IL-6、TNF-α含量：各给药组小鼠血浆IL-6、TNF-α水平均显著低于模型组小鼠(P<0.00)；辛伐他汀组小鼠血浆IL-6与小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；小檗碱低剂量组小鼠血浆IL-6与小檗碱中剂量组差异无统计学意义(P=0.277)；小檗碱高剂量组小鼠血浆IL-6与小檗碱中剂量组差异无统计学意义(P=0.343)。小檗碱高剂量组小鼠血浆TNF-α与辛伐他汀组、小檗碱中剂量组、小檗碱低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；辛伐他汀组小鼠血浆TNF-α显著低于小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组(P<0.05)；小檗碱低剂量组小鼠血浆TNF-α与小檗碱中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。8.Visfatin对HUVEC增殖的影响：visfatin浓度梯度组结果显示：50、100、150、200μg·L-1visfatin组均可显著抑制HUVEC增殖(P<0.05)；100μg·L-1visfatin与150μg·L-1visfatin组、200μg·L-1visfatin组差异无统计学意义(P>0.05)；visfatin时间梯度组结果显示：与对照组相比,100μg·L-1visfatin作用12h、24h、48h后均能显著抑制]3UVEC增殖(P<0.05),100μg·L-1visfatin作用24h与作用3h、6h、12h相比对HUVEC增殖抑制的差异有统计学意义(P<0.05)；100μg·L-1visfatin组作用24h与作用48h对HUVEC增殖抑制的差异无统计学意义(P>0.05)。9小檗碱及MAPKs通路抑制剂对visfatin影响HUVEC增殖的干预作用：50、100μmol·L-1小檗碱均可显著减轻visfatin对HUVEC增殖的抑制作用(P=0.00)；两组间无显著差异;P>0.05)。PD98059、SB203580和SP600125均可显著减轻visfatin对于IUVEC增殖的抑制(P<0.05),三组间无显著差异(P>0.05)；PD98059、SB203580和SP600125减轻visfatin对]HUVEC增殖的抑制能力与小檗碱组无显著差异(P>0.05)。10.Visfatin对HUVEC中p-ERK1/2蛋白表达的影响：浓度梯度组结果显示：50μg·L-1visfatin作用24h后即可显著增高HUVEC中p-ERK1/2蛋白的表达(P–0.00),100、200μg·L-1visfatin作用24h后HUVEC中p-ERK1/2蛋白表达的增高较50μg·L-1visfatin组有显著差异(P=0.00)；时间梯度组结果显示：100μg·L-1visfatin作用12h后可显著增高HUVEC中p-ERK1/2蛋白的表达;P=0.024),100μg·L-1visfatin作用24h、48h组较作用12h组HUVEC中p-ERK1/2蛋白表达增高的差异具有显著性(P=0.00),24h和48h两组间无显著差异(P=0.236)。11.Visfatin对HUVEC中p-p38MAPK蛋白表达的影响：浓度梯度组结果显示：50μg·L-1visfatin作用24h后即可显著提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表达(P=0.016),100μg·L-1visfatin作用24h后此作用达到峰值(P=0.00),100μg·L-1visfatin组与200μg·L-1visfatin组对于提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表达,两组间无显著差异(P=0.317)；时间梯度组结果显示：100μg·L-1visfatin作用作用12h后即可显著提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表达(P=0.003),作用24h后提高HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表达作用达到峰值(P=0.00)。12.Visfatin对3UVEC中p-JNK蛋白表达的影响：浓度梯度组结果示：100μg·L-1visfatin组和200μg·L-1visfatin作用24h后均可显著提高HUVEC中p-JNK蛋白的表达(P=0.00),两组间无显著差异(P=0.593)；时间梯度组结果显示：100μg-L-1visfatin作用12h后可显著提高HUVEC中p-JNK蛋白的表达(P=0.001),与作用6h组有显著差异(P=0.008),作用24h后提高IUVEC中p-JNK蛋白的表达作用达到峰值(P=0.00)。13.Visfatin诱导HUVEC分泌TNF-α、IL-6的作用：浓度梯度组结果示：100、200μg·L-1visfatin分别作用24h均可显著诱导HUVEC分泌TNF-a及IL-6(P=0.00),100μg·L-1visfatin诱导HUVEC分泌TNF-a作用显著高于200μg·L-1visfatin组(P=0.00)。时间梯度组结果显示：100μg·L-1visfatin作用6h后即可显著诱导HUVEC分泌TNF-a(P=0.001),作用24h后达峰值(P=0.00)。100μg·L-1visfatin作用12h后可显著诱导HUVEC分泌IL-6(P=0.00),作用24h后达峰值(P=0.00),较12h组有显著提高(P=0.00)。14.小檗碱及MAPKs通路抑制剂对HUVEC中p-ERK1/2,p-p38MAPK、JNK蛋白表达的影响：与visfatin组相比,小檗碱和PD98059均可显著降低HUVEC中p-ERK1/2蛋白的表达(P=0.00)；小檗碱和SB203580均可显著降低HUVEC中p-p38MAPK蛋白的表达(P=0.00)；小檗碱和SP600125均可显著降低HUVEC中p-JNK蛋白的表达(P=0.00)。15小檗碱及MAPKs通路抑制剂对visfatin诱导HUVEC分泌TNF-α、IL-6的干预作用：与visfatin组相比,用50μmol·L-1小檗碱预先处理HUVEC1h可显著降低HUVEC分泌TNF-α、IL-6水平(P=0.00);PD98059、SB203580、SP600125均可显著降低由visfatin诱导的HUVEC分泌炎症因子TNF-α及IL-6(P<0.05)。结论：1.小檗碱对AS小鼠具有减体重及降血脂作用。2.AS小鼠主动脉及斑块内visfatin显著增高,小檗碱可抑制ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块病变的形成,并降低AS主动脉及斑块内visfatin的表达。3.AS小鼠血清visfatin显著增高,小檗碱可降低AS小鼠血清visfatin含量。4.AS小鼠血浆炎症因子TNF-α、IL-6水平显著增高,小檗碱可降低AS小鼠血浆TNF-α、IL-6水平。5.Visfatin可呈浓度和时间依赖性显著抑制HUVEC增殖并明显诱导HUVEC分泌TNF-α、IL-6其机制可能通过激活p38MAPK,ERK1/2和JNK通路实现；小檗碱可显著减少visfatin对HUVEC增殖的抑制,可明显降低由visfatin诱导的HUVEC分泌炎症因子TNF-α及IL-6,可能与抑制p38MAPK,ERK1/2和JNK通路有关。综上,动物实验证实AS小鼠具有高血脂,炎症因子TNF-α、IL-6及与炎症有关的脂肪细胞因子visfatin的高度表达的特征,小檗碱可通过降血脂、抑制AS斑块的形成、减少TNF-α、IL-6的含量、下调visfatin的表达等方面延缓AS的发生发展。细胞实验证实visfatin可损伤内皮细胞并可诱导内皮细胞分泌炎症因子,小檗碱可通过保护内皮细胞及减少炎症因子的分泌发挥抗AS作用,其机制可能有抑制MAPKs信号通路有关。
【作者】万强；
【导师】贾钰华；
【作者基本信息】南方医科大学，中西医结合临床，2014，博士
【关键词】动脉粥样硬化；内脏脂肪素；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α；丝裂原活化蛋白激酶；小檗碱；
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