基于NR3A和PP2A表达上调探讨辛伐他汀对缺血性脑卒中的保护作用

【摘要】研究背景脑卒中是中老年人的常见病、多发病,与心脏病、恶性肿瘤构成目前人类的三大致死性疾病,具有高致残率和高致死率的特点,缺血性脑卒中约占脑卒中的60%-70%,近年来其罹患率逐年增长,并有年轻化趋势。缺血性脑卒中发病机制中脑缺血再灌注损伤是导致神经元死亡的主要原因,而神经兴奋性毒性作用一直都是脑缺血再灌注损伤研究的核心问题,积极致力于它的研究并寻求有效的药物来预防和治疗该类疾病显得尤为重要。他汀类药物是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(hydroxy-methyl-glutarylcoenzymeA,HMG-CoA)还原酶抑制剂,可以降低胆固醇合成,研究发现它还对心脑血管疾病具有多重保护作用,而这些作用的起效不依赖于其降胆固醇的作用,称之为他汀类药物的多效性。通过对多种他汀类药物的比较发现,辛伐他汀(simvastatin)脂溶性较高,易穿过血—脑屏障且对脑缺血损伤的保护作用最好。N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDAR)由NR1、NR2和NR3亚单位构成,NR2又包含NR2A、NR2B、NR2C、NR2D四个亚基,NR3包含NR3A和NR3B两个亚基。传统的NMDAR由NR1和不同的NR2亚单位构成,在谷氨酸的作用下,NMDAR激活,Na+、K+,Ca2+内流(占主要)并激活下游的信号通路,对神经系统的功能活动进行调节,在脑缺血再灌注损伤的病理情况下,谷氨酸大量生成,NMDAR过度激活后Ca2+内流增多,级联放大下游的信号通路,产生兴奋性毒性损伤作用。1995年,NR3A亚单位被首次报道,它在脑中的表达具有时间和空间特异性。通过对NR3A转基因小鼠海马神经元上的新型NMDAR,及瓜蟾卵母细胞、HEK293上利用融合基因方法形成的含有NR3A的新型受体的研究发现,与传统NMDAR比较,这类受体对谷氨酸不敏感,激活后Ca2+内流相对减少。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和蛋白磷酸酶可以通过磷酸化和去磷酸化对机体多种蛋白分子的功能活动进行调节,NR1亚单位上有丝氨酸磷酸化位点(Ser896和Ser897),这些磷酸化位点激活后NMDAR活动上调,Ca2+内流增多,而蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A,PP2A)可使NR1亚单位上的丝氨酸磷酸化位点去磷酸化,抑制NMDAR的活动。研究目的辛伐他汀对缺血性脑卒中的保护作用中是否有NR3A和PP2A的参与,NR1亚单位上丝氨酸位点的磷酸化情况如何,Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependentproteinkinaseⅡ,CaMKⅡ)作为间接反映NMDAR过度激活的下游信号分子,其自磷酸化水平又如何改变,PP2A是否对NR3A具有正向调节作用。研究方法辛伐他汀预给药7天后,制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)(缺血1小时再灌注24或12小时),动物分组：sham组、MCAO组、vehicle+MCAO组和sim+MCAO组。1.进行神经功能缺失评分、2,3,5—三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色测量脑梗死面积、干/湿重法测量脑组织含水量、磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)扫描；2.苏木素伊红(hematoxylineosin,HE)染色、Nissl染色、Hoechst33258染色观察细胞形态结构；3.丝氨酸/苏氨酸磷酸酶检测试剂测定大鼠海马CA1区PP2A酶活性：4.实时荧光定量聚合酶链反应(realtimefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,real-timeqPCR)检测大鼠海马CA1区NR1和NR3A的基因表达变化；5.蛋白免疫印迹法(westernblot)检测大鼠海马CA1区NR1(Ser896,Ser897)磷酸化水平、NR3A蛋白水平、CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平、PP2A催化亚单位(catalyticsubunit,Csubunit)及水孔蛋白4(aquaporin4,AQP4)的蛋白表达变化；6.正常大鼠单独辛伐他汀给药7天后,丝氨酸/苏氨酸磷酸酶检测试剂检测大鼠海马CA1区PP2A酶活性,westernblot检测海马CA1区PP2A的C亚单位和NR3A蛋白表达变化；7.免疫共沉淀观察正常成年大鼠海马组织中NR3A和NR1、AQP4、CaMKⅡ及PP2A之间是否有免疫复合物形成；8.辛伐他汀预给药7天,大鼠海马CA1区冈田酸(okadaicacid,OA)微量注射干预后再造MCAO模型,westernblot检测PP2A和NR3A蛋白表达变化;9.正常大鼠海马CA1区微量注射鞘氨醇(sphingosine)或OA后,westernblot检测PP2A、NR3A和NR1蛋白表达变化。研究结果1.辛伐他汀减少神经功能缺失体征、脑梗死面积和脑水肿Sham组大鼠没有神经功能缺失体征及脑梗死,MCAO组大鼠神经功能缺失体征和脑梗死明显,与MCAO组比,sim+MCAO组大鼠神经行为学评分明显降低(n=8,P<0.01),脑梗死面积显著降低(n=6,P<0.01)。与sham组比,MCAO组缺血侧脑含水量明显增加(n=6,P<0.01),而与MCAO组比,sim+MCAO组缺血侧脑含水量减少(n=6,P<0.05)。缺血对侧大脑半球脑含水量在各组间没有明显变化。2.辛伐他汀改善海马CA1区神经细胞功能形态与sham组比,vehicle+MCAO组海马CA1区神经元变性,出现核固缩和胞浆空泡,凋亡细胞增多,sim+MCAO组变性的神经元明显减少。3.辛伐他汀减少NR1(Ser896,Ser897)磷酸化脑缺血再灌注24h,与sham组比,MCAO组NR1(Ser896,Ser897)磷酸化水平增加(n=5,P<0.01),而与MCAO组比,sim+MCAO组NR1(Ser896,Ser897)磷酸化水平降低(n=5,P<0.01和P<0.05)；与假手术组比,MCAO组和sim+MCAO组总NR1蛋白表达水平均降低(n=5,P<0.05)。脑缺血再灌注12h,与sham组比,MCAO组和sim+MCAO组NR1基因表达水平均降低(n=5,P<0.01)。4.辛伐他汀增加NR3A表达脑缺血再灌注12h、24h,与sham组比,MCAO组这两个时间点的NR3A基因表达水平均明显降低(n=5,P<0.01)；而与vehicle+MCAO组比,sim+MCAO组在12h时间点NR3A基因表达水平升高(n=5,P<0.05),在24h时间点sim+MCAO组NR3A基因表达水平较MCAO组和vehicle+MCAO组均明显升高(n=5,P<0.01)。脑缺血再灌注12h,各组的NR3A蛋白表达变化不具有统计学意义；脑缺血再灌注24h,MCAO组NR3A蛋白表达水平较sham组明显降低(n=5,P<0.01),而与MCAO组比,sim+MCAO组NR3A蛋白表达水平明显升高(n=5,P<0.01)。5.辛伐他汀减少CaMKⅡ(Thr286)磷酸化脑缺血再灌注24h,与sham组比,MCAO组CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平明显升高(n=6,P<0.01),而与MCAO组比,sim+MCAO组CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平明显降低(n=6,P<0.01)。6.辛伐他汀增加PP2A表达脑缺血再灌注24h,与sham组比,MCAO组的PP2A酶活性下降(n=6,P<0.01),与MCAO组比,sim+MCAO组PP2A酶活性升高(n=6,P<0.01)。脑缺血再灌注12h,PP2A的C亚单位蛋白表达变化不具有统计学意义；脑缺血再灌注24h,与sham组比,MCAO组PP2A的C亚单位蛋白表达水平降低(n=6,P<0.05),而与MCAO组比,sim+MCAO组PP2A的C亚单位蛋白表达水平升高(n=6,P<0.05)。7.辛伐他汀减少AQP4表达脑缺血再灌注24h,与sham组比,MCAO组AQP4蛋白表达水平明显升高(n=6,P<0.01),与MCAO组比,sim+MCAO组AQP4蛋白表达水平下降(n=6,P<0.05)。8.辛伐他汀单独给药对PP2A和NR3A表达没有影响正常大鼠辛伐他汀单独灌胃给药7天后,海马组织中PP2A的C亚单位和NR3A蛋白表达与生理盐水溶媒对照组比,差异不具有统计学意义。9.免疫共沉淀观察正常大鼠海马组织中复合物形成情况正常大鼠海马组织中NR3A和NR1、AQP4、CaMKⅡ之间均有免疫复合物形成,但NR3A和PP2A之间未能检测到复合物。10.PP2A对NR3A的调节与sim+DMSO+MCAO组比,sim+OA+MCAO组PP2A的C亚单位蛋白表达变化不具有统计学意义,但NR3A蛋白表达明显下降(11=6,P<0.01)。正常大鼠海马CA1区微量注射sphingosine或OA后,各组间PP2A的C亚单位蛋白表达变化不具有统计学意义；与normal+DMSO组比,normal+SP组NR3A蛋白表达水平升高(n=5,P<0.01),而normal+OA组NR3A蛋白表达水平降低(n=5,P<0.05)；与normal+DMSO组比,normal+SP组NR1蛋白表达水平降低(n=5,P<0.01),而normal+OA组NR1蛋白表达水平升高(n=5,P<0.05)。结论1.辛伐他汀通过上调NR3A和PP2A表达,减少NRl丝氨酸磷酸化,及CaMKⅡ自磷酸化对缺血性脑卒中产生保护作用。2.辛伐他汀通过降低AQP4蛋白表达,减轻缺血性脑卒中发病过程中的脑水肿。3.NR3A和AQP4、CaMKⅡ之间具有蛋白交联关系,NR3A可能为水孔蛋白和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶之间的信号传递承担中介作用。4.NR3A和PP2A之间未能检测到蛋白交联,但PP2A对NR3A的表达具有正向调节作用,NR3A表达增多竞争性抑制NRl表达,这可能为新型NMDAR的形成创造了条件。
【作者】朱敏侠；
【导师】朱大年；
【作者基本信息】复旦大学，生理学，2013，博士
【关键词】辛伐他汀；缺血性脑卒中；脑缺血再灌注损伤；N-甲基-D-天冬氨酸受体；兴奋性毒性；NR3A；蛋白磷酸酶2A；NR1；Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ；水孔蛋白4；

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