EPB49在结直肠癌发生发展和转移过程中的作用和分子机制研究

【摘要】研究背景和目的：结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,发病率和肿瘤相关死亡率位居所有肿瘤的第三位。近些年来,随着人们生活方式和饮食结构的转变,世界范围结直肠癌的发病率呈上升的趋势,且发病年龄呈现年轻化的特点。转移是引起结直肠癌患者死亡的首要原因,在初次诊断和临床治疗过程中,大约40-50%的患者可检测到转移灶。肝脏是结直肠癌转移的主要靶器官,结直肠癌肝转移是临床上根治性手术失败的主要原因。因此,晚期结直肠癌严重危害人们的身体健康、影响患者的生活质量,同时也给社会带来沉重的经济负担。结直肠癌发生和转移的具体分子机制目前还不完全清楚。结直肠癌的发生是一个多步骤、多阶段和多基因参与的过程,在此过程中常常伴有癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡调节基因、DNA修复基因改变以及端粒酶活性的增加。结直肠癌的转移机制也十分复杂,涉及癌细胞和宿主两方面之间的相互作用,细胞粘附下降、细胞运动能力增强、细胞骨架改变、EMT、肿瘤微环境的变化以及肿瘤间质细胞和肿瘤细胞分泌囊泡的异常等在转移的过程中发挥着重要的作用。鉴于此,深入研究结直肠癌的发生、发展和转移的机制,对开发有效的治疗措施、提高结直肠癌的生存率具有重要的临床价值和社会效益。EPB49基因定位于人染色体8p21.1,长度为15kb,编码EPB49蛋白,又名Dematin(DMTN)。EPB49蛋白最先在人红细胞膜骨架中被鉴定,是一种肌动蛋白结合蛋白,分子内部存在肌动蛋白结合位点,可直接与细胞骨架肌动蛋白结合参与细胞骨架的重构。细胞骨架结构和功能的改变是导致肿瘤形成和发展的必不可少的重要因素之一,在细胞恶性转化过程中恶性表型的获得常与肌动蛋白相关蛋白的异常表达相伴。目前已知的EPB49蛋白的生物功能主要是参与维持红细胞的形状和细胞膜的完整性,其肌动蛋白结合活性受蛋白磷酸化的调节。EPB49蛋白主要在造血系统细胞(包括红细胞、血小板、淋巴细胞)中表达,但是研究显示心肌细胞、内皮细胞和上皮细胞、骨骼肌细胞和肾细胞中EPB49也都有表达。这种在不同器官和组织中广泛的表达,提示其可能在红细胞以外的细胞中调控肌动蛋白骨架以及其他生物学功能方面也发挥着重要的作用。EPB49蛋白表达失调与一些肿瘤的发生有着密切的关系。EPB49基因定位于人染色体8p21.1,在前列腺癌患者中常伴有该染色体区域的杂合性缺失,在前列腺癌PC-3细胞株中,过表达EPB49可以使该细胞恢复上皮样细胞形态表型、抑制细胞的运动能力,并能抑制RhoA的活性。我们在前期工作中通过全基因组表达谱芯片筛选发现EPB49为可能的候选结直肠癌转移抑制相关基因,EPB49在结直肠癌组织中表达下降,其低表达与结直肠进展呈正相关。然而,目前尚未见EPB49在肿瘤中的表达研究,EPB49在发生发展中的功能及分子机制亦知之甚少。此外,EPB49在肿瘤中的表达下降,其调控机制亦不清楚。本课题拟检测EPB49在结直肠癌中的表达情况,分析其表达与相关临床病理参数之间的关系；通过体内外实验,研究EPB49在结直肠癌发生、发展和转移过程中的作用和相关的分子机制；探讨EPB49异常表达的上游调控机制。方法：1.利用公共数据库数据(GEO数据库和Oncomine数据库)分析EPB49在结直肠癌及其他恶性肿瘤中的表达情况；2.利用免疫组织化学(IHC)、免疫印迹(westernblot)和荧光实时定量PCR(Real-timequantitativePCR,RT-PCR)检测结直肠癌石蜡样本和新鲜样本中EPB49的表达,并分析EPB49的表达与肿瘤分化、分期、转移和临床预后等相关临床病理参数的关系；3.建立EPB49稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株,通过MTT、平板克隆形成、软琼脂克隆形成和裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的增殖,通过流式细胞技术检测细胞周期分布,通过Transwell实验、划痕实验和三维培养实验和裸鼠原位移植瘤实验检测细胞的侵袭迁移能力；4.激光共聚焦技术观察EPB49稳定过表达和干扰后结直肠癌细胞的形态、片状伪足形成和细胞粘附的改变；5.利用公共数据库(GEO数据库),通过GSEA基因富集的方法分析结直肠癌中EPB49低表达组中上调的信号通路(包括Rac1、RhoA、CDC42等信号通路)；6.利用westernblot检测EPB49稳定过表达和干扰后Racl-GTP的表达情况,通过激光共聚焦和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)技术验证EPB49和Tiam的相互作用情况以及作用的具体位点,通过恢复实验进一步验证EPB49和Tiam相互作用调控Racl的活性；7.利用公共数据库(GEO数据库),通过GSEA基因富集的方法分析结直肠癌中EPB49低表达组中Wnt_beta-cateni、MAPK等信号通路的富集情况；8.利用免疫荧光、westernblot和双荧光素酶报告基因实验检测Wnt、MAPK等信号通路的激活情况、EMT标志物表达的变化、Wnt和MAPK等信号通路靶基因的表达情况；9.UCSC数据库预测EPB49的CpG岛,通过重亚硫酸盐的测序(BisulfiteGenomicSequence,BSP)实验检测结直肠癌组织样本中CpG岛的甲基化情况,同时通过RT-PCR检测结直肠癌组织样本中EPB49的表达情况,结合二者结果分析CpG岛甲基化程度与EPB49表达的相关性。结果：1.EPB49在结直肠癌组织中的表达1)公共数据库中EPB49在结直肠癌中的表达情况Oncomine在线软件分析结果显示,符合入选标准的数据库共有12个,其中5个数据库中EPB49表达上调,7个数据库表达下调,尤其是TCGA数据库中大样本芯片数据(881例)显示结直肠癌中EPB49表达下调。GSEA基因富集分析显示,在结直肠癌组织表达谱芯片GSE13294和GSE35896数据中,结直肠癌相关基因集‘’KEGG_COLORECTALCANCER”在EPB49低表达组中上调,其相关基因显著富集(ES=0.4,P<0.05)。2)结直肠癌组织中EPB49表达水平的检测IHC结果显示EPB49阳性表达主要定位于细胞膜和细胞质,呈棕红色或黄褐色,在79.5%(169/200)的结直肠癌病例中,正常结直肠组织EPB49蛋白表达水平高于相配对的肿瘤组织；westernblot和RT-PCR结果显示正常结直肠组织中的EPB49蛋白和mRNA表达水平高于相配对的肿瘤组织。3)EPB49的表达水平和临床病理参数之间的关系EPB49的表达水平在不同年龄组、不同性别之间没有显著差异(P>0.05)；EPB49的表达水平在不同分化程度、不同Dukes分期、不同TNM分期及转移和非转移的结直肠癌中的差异具有统计学意义(P<0.05),并且二者之间呈负相关关系。Kaplan-Meier法生存分析结果显示,EPB49高表达组结直肠癌的5年总体生存率显著高于低表达组,统计学上有显著差异(Log-Rank,P<0.05),并且随着EPB49表达的减弱,总体生存曲线逐渐下降。2.EPB49在结直肠癌进展过程中的作用1)EPB49过表达和干扰慢病毒载体的构建,稳定表达细胞株的建立利用分子克隆技术构建了EPB49过表达和干扰的慢病毒表达载体,测序鉴定,结果显示插入的序列正确,无突变、缺失或者框移。利用慢病毒载体构建了EPB49稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株,并采用westernblot实验进行了验证。2)EPB49稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞增殖能力的影响MTT实验结果显示,与对照组相比EPB49稳定过表达的细胞生长速度显著下降(P<0.05),EPB49被干扰的细胞株的生长速度显著快于对照组(P<0.05)。平板克隆形成和软琼脂集落形成实验结果显示,与对照组相比EPB49稳定过表达细胞形成的克隆数量显著减少(P<0.05),EPB49被干扰的细胞株形成的克隆数量显著多于对照组(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比EPB49过表达组肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小(P<0.05),EPB49干扰组肿瘤生长速度较快,肿瘤体积较大(P<0.05)；并且EPB49过表达组的Ki67的阳性率(33.33%)显著低于对照组(86.67%)(P<0.05),EPB49干扰组的Ki67的阳性率(89.67%)显著高于对照组(63.67%)(P<0.05)。3)EPB49稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞EMT表型及侵袭迁移能力的影响westernblot和免疫荧光实验结果显示,结直肠癌中EPB49的表达在TGF-β处理72h后显著下降；并且在结直肠癌细胞HCT116和SW480中过表达EPB49后,上皮标记物E-cadherin的表达上调,而间质标记物vimentin的表达下调；相反,在结直肠癌细胞HT29和SW620中干扰EPB49后,上皮标记物E-cadherin的表达下调,而间质标记物vimentin的表达上调。Transwell细胞迁移实验结果显示,与对照组相比稳定过表达EPB49的细胞株迁移细胞的数量明显减少(P<0.05)；而EPB49被干扰的细胞株迁移细胞的数量则显著多于对照组(P<0.05)。划痕实验结果显示,与对照组相比稳定过表达EPB49的细胞株迁移速度明显减慢；而EPB49干扰细胞株细胞迁移的速度则显著快于对照组。三维细胞球侵袭实验结果显示与对照组相比,稳定过表达EPB49的细胞株向周围基质中浸润的突起明显减少；而EPB49干扰细胞株向周围基质中浸润的突起显著多于对照组。3.EPB49在结直肠癌进展过程中的作用机制1)EPB49低表达的结直肠癌中被上调的信号通路的分析GSEA基因富集分析结果显示,在基因芯片GSE13067和GSE35896数据中,RHO_GTPASES和Rac1通路在EPB49低表达的结直肠癌中出现上调,并且通路相关基因显著富集(P<0.05)。2)EPB49对Racl活性调节作用激光共聚焦显微镜和westernblot实验结果显示,在形态多为梭形的结直肠癌细胞(HCT116和SW480)中,EPB49的表达水平较低,而Rac1-GTP的表达较高；在形态为圆形的结直肠癌细胞(HT29和SW620)中,EPB49的表达水平较高,而Rac1-GTP的表达较低。westernblot实验结果显示,与对照组相比在结直肠癌细胞株HCT116和SW480中过表达EPB49后,Rac1-GTP的表达下降；相反,在HT29和SW620中干扰EPB49后Rac1-GTP的表达上升。3)EPB49对结直肠癌细胞形态和细胞骨架的影响激光共聚焦实验结果显示,结直肠癌亲本细胞HCT116和SW480形态多呈梭形,细胞伸出较多的伪足,过表达EPB49后HCT116和SW480形态转变为圆形,细胞的片状伪足减少；相反,HT29和SW620形态多呈圆形,干扰EPB49后细胞形态转变为较短的梭形,细胞伸出的伪足增多。4)EPB49通过与鸟苷酸交换因子Tiam1相互作用,抑制Tiam1对Racl激活westerblot实验结果表明,与对照组vector相比在结直肠癌细胞SW480中转染Tiam1后Rac1-GTP表达水平增加；共转染Tiaml和EPB49后,Racl-GTP表达水平反而又受到抑制。免疫荧光共定位结果显示,在结直肠癌细胞株HCT116、SW480、HT29和SW620中均存在EPB49和Tiaml的共定位,共定位与细胞膜和细胞质。Co-IP实验结果显示,EPB49和Tiaml能够相互作用,EPB49通过核心结构域CD的第226-336位氨基酸与Tiaml相互作用,而Tiaml通过DH、PHc和PHn结构域与EPB49相互作用。与对照组vector相比在结直肠癌细胞SW480中转染Tiaml后Racl-GTP表达水平增加；共转染Tiam1和EPB49后,Racl-GTP表达水平反而又受到抑制。此外,与Tiaml共转染M1、M3和M5实验组的Racl-GTP表达水平减低,进一步证明说明EPB49能够通过核心结构域CD与Tiaml的DH、PHc和PHn结构域结合相结合,抑制Tiaml对Racl的激活。5)EPB49对结直肠癌细胞中Wnt和MAPK信号通路的影响GSEA基因富集分析结果显示,Wnt_beta-catenin信号通路基因集在EPB49低表达的及直肠癌中上调,且相关通路基因显著富集(P<0.05)。TOP和FOP双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比在结直肠癌细胞HCT116中过表达EPB49后TOP/FOP减小,说明Wnt信号通路活性降低(P<0.05)；在结直肠癌细胞SW620中干扰EPB49后TOP/FOP增大,说明Wnt信号通路活性增高。westemblot实验实验结果显示,在结直肠癌细胞HCT116和SW480细胞中过表达EPB49后,CyclinD1和p-JNK表达水平下调,p27表达水平上调；而在结直肠癌细胞HT29和SW620细胞中干扰EPB49后结果则相反。4.结直肠癌中EPB49的上游调控机制1)EPB49基因在结直肠癌中缺失和突变情况的分析生物信息学分析结果显示,在TCGA(Provisional)和TCGA(Nature2012)两个数据库EPB49的缺失率分别为6.3%(37/589)和2%(5/257),在Colorectal(Genentech)数据库中EPB49的突变率为1.4%(1/72)。2)EPB49基因CpG岛的分析和预测UCSC数据库预测结果显示,在EPB49基因的启动区和第一外显子区分别存在1个CpG岛,GC含量分别为72.0%和71.2%,片段长度分别为250bp和793bp,CpG最低出现率分别为0.62和0.89,CG数量分别为20个和89个。GEO芯片数据库中结直肠癌甲基化芯片数据GSE39334分析结果显示,结直肠癌中CpG岛相关位点的甲基化程度高于正常肠粘膜组织。3)5-Aza-CdR处理结直肠癌细胞后EPB49表达情况的变化RT-PCR和westemblot实验结果显示,采用去甲基化药物5-Aza-CdR处理结直肠癌细胞后,EPB49的表达水平随着药物浓度的增加而逐渐升高,并且呈浓度依赖关系。4)结直肠癌组织中EPB49CpG岛甲基化程度的检测BSP实验结果显示,5例正常肠粘膜组织中EPB49CpG岛的甲基化程度分别为5%、15%、10%、25%和20%,而在相对应的结直肠癌组织中EPB49CpG岛的甲基化程度则分别为15%、50%、45%、70%和65%,肿瘤组织中的EPB49CpG岛的甲基化程度显著高于正常肠粘膜组织。5)结直肠癌组织中EPB49的表达和CpG岛甲基化程度相关性的分析RT-PCR和BSP实验结果显示,结直肠癌组织中EPB49的表达和CpG岛甲基化程度之间表明成负相关关系,随着CpG岛甲基化程度增高,EPB49的表达水平逐渐下降。结论：1.结直肠癌组织中EPB49表达水平显著下调;EPB49的表达水平与分化、Dukes分期、TNM分期、转移和预后等临床病理参数之间呈负相关关系。2.EPB49过表达抑制结直肠癌细胞的增殖、EMT表型和侵袭迁移能力,而干扰EPB49后则促进肿瘤细胞增殖、EMT表型和侵袭迁移能力；3.EPB49抑制Racl信号通路活性,其分子机制可能与EPB49和Tiaml相互作用有关；4.EPB49调节细胞骨架重构、Wnt和MAPK信号通路活性;5.EPB49基因在结直肠癌中表达下调,其调控机制可能与启动子CpG岛甲基化有关。
【作者】冶亚平；
【导师】丁彦青；廖雯婷；
【作者基本信息】南方医科大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】结直肠癌；EPB49；增殖；侵袭；Tiaml；Racl；

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