海南岛传疟蚊媒种群密度、杀虫剂抗性及发生机制研究

【摘要】研究背景：疟疾(Malaria)是危害公众健康和阻碍社会经济发展一个重要问题,传播媒介是按蚊(Anopheles)到目前为止,疟疾不再是不可防治的疾病,人类在疟疾控制方面取得重大成就之一是传疟媒介得到了有效控制。使用浸泡过除虫菊酯类药物的蚊帐和室内喷洒杀虫剂是控制蚊媒的主要措施。然而,长期大量使用杀虫剂在大大削减传疟蚊虫种群密度的同时也改变了其种群结构,并引起抗药性。为了彻底消除疟疾,研究抗药机制势在必行。众所周知,蚊媒对杀虫剂的抗性机制主要包含两大类：代谢解毒和靶标敏感性下降。代谢解毒产生的抗药性(代谢抗药性)主要是蚊虫通过体内解毒代谢酶基因扩增或过量表达,增强解毒代谢酶活性,从而降低杀虫剂毒性,阻断杀虫剂作用到抗性昆虫的靶标。其中,细胞色素单加氧酶P450氧化酶家族(单加氧酶P450s)、非专一性酯酶系(ESTs)和谷胱甘肽转移酶-S-转移酶系(GSTs)为主要的代谢性解毒酶。靶标敏感性降低产生的抗药性(靶标抗药性)主要是指由于抗性蚊体内的杀虫剂作用靶标基因发生突变,降低了其与杀虫剂的结合,从而使蚊虫对杀虫剂的敏感性降低而产生的抗性。杀虫剂对蚊媒作用的靶标主要有3种：有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标乙酰胆碱酯酶(AChE);DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标神经轴突钠离子通道(SC)；环戊二烯类和吡唑类、二环磷酯类、二环苯甲酸酯类杀虫剂的作用靶标Y-氨基丁酸(GABA)受体-氯离子通道复合体。中国的恶性疟疾发病主要集中在海南岛和云南省。海南岛是被30公里宽的琼州海峡与中国大陆隔离的一个孤岛,南部主要为山脉,也是曾经全岛疟疾流行的高发区域。海南岛主要以种植水稻为主,一年三季,水稻田有利于传疟按蚊的孳生。十年前,微小按蚊(Anophelesminimums)作为海南岛主要传播疟疾的蚊媒,经过大量杀虫剂的使用已经得到了很好的控制,其种群几乎灭绝。而中华按蚊(Anophelessinensis)、棋斑按蚊(Anophelestessellatus)、迷走按蚊(Anophelesvagus)等其他传播疟疾的蚊媒种群却在十年后的今天大量被报道。为了彻底控制海南岛传疟媒介,本课题对目前海南岛主要传疟媒介的种群密度、对杀虫剂的抗药性及其发生机制进行了如下研究：一、研究方法：1.海南岛主要传疟蚊媒种群密度及杀虫剂使用情况调查2012年7月到8月,根据海南岛不同的地势和海拔,对海南岛12个地点传疟蚊媒种群密度进行了调查,最后在临高、陵水、文昌、澄迈、定安、屯昌、保亭和三亚8个调查点收集到了研究所需的按蚊幼虫、蛹和成虫,我们按照采集到的幼虫数量研究种群密度。采集到的主要传疟按蚊有三种：中华按蚊、棋斑按蚊和迷走按蚊。幼虫采集采用幼虫勺定点捞法,在采集点随机选取5个按蚊孳生地,采用5个孳生地的350m1勺子舀水中所含幼虫个数的平均数计为幼虫的密度。所有幼虫均采自水稻田。成虫采集自农户家中牛或猪圈内,用专用吸蚊器吸取,取单位时间内捕捉到的成虫个数,除以单位时间的平均数计为当地成蚊的密度。蚊种的鉴定方面,我们主要根据幼虫室内孵化为成蚊肉眼形态观察和实验室PCR扩增蚊ITS2和28SD3区域确定。在采集样本的同时,我们询问农户及周边出售农药的供销社调查海南目前各地使用的农药。2.海南岛主要传疟蚊媒杀虫剂抗性的生物学测定我们采用WHO推荐的标准成蚊筒内药膜接触法进行生物学活性测定。药膜采用WHO规定的浓度：溴氰菊酯0.05%,DDT4.0%和马拉硫磷5%,同时制备对照组药膜(均由中国CDC提供)。测试按蚊为我们从海南8个地点采集的幼虫和蛹进行室内孵化培养,选取羽化后三天的未吸血雌蚊,20只为一批,每个地点每种药膜均测定5批,一个地点的一种药物选用一张对照药膜测试20只未吸血的雌蚊作为对照。操作方法参照由中国标准出版社出版的《蚊虫抗药性检测方法生物测定法(GB/T26347-2010)》：分别取20只未吸血的雌蚊吸入装有实验药膜和对照药膜的接触筒中,观察第10、15、20、30、40、50和60分钟被击倒的蚊虫个数,并记录首次击倒时间。1蚊虫小时后仍未被击倒的蚊虫转入恢复筒,用8%的葡萄糖溶液喂养,观察24小时后继续存活的蚊虫为杀虫剂抗性蚊,24小时内被击倒的蚊虫则为杀虫剂敏感蚊。根据击倒顺序标记每只蚊虫,击倒和存活的每只蚊虫单管保存在1.5mlEP管内,-20℃保存备用。3.海南岛主要传疟蚊媒代谢解毒酶活性测定3.1KP04蚊酶液制备在冰上取下每只蚊虫的头和足,放入装有2000L无水乙醇的0.5mLEP管内,按照原来的标记进行标记,-20℃保存。将每只蚊虫的剩余部分在试管内加入3000LKPO4(0.25M)缓冲液在冰上充分研磨,1,3000rpm离心5分钟后取上清液转入2.0mLEP管内,并用KP04缓冲液稀释至1.5mL,即为蚊虫酶液。残渣加入200pL无水乙醇,也按照原来的标记对应标记-20℃保存。蚊虫酶液用于测定谷胱甘肽转移酶转移酶(GST)、单加氧酶P450、羧酸酯酶(COE,又名CES)代谢解毒酶活性测定及蛋白含量。3.2蛋白含量的测定取单只蚊虫的40μL蚊酶液移入一次性比色杯(d=1),再取0.25MKPO4缓冲液40pL移入另一只一次性比色杯作为空白对照。分别加入9000L考马斯亮蓝染色液,5分钟后分别在波长为595nm的分光光度计上读取OD值两次。两次读数的平均值(即平均OD值)分别代入根据牛血清白蛋白制定的标准曲线方程Y=28.977X2-22.201X+5.1657计算蛋白含量,其中,X为OD,Y为蛋白含量。实验样品与空白对照之差即为所测40uL蚊酶液的蛋白含量。然后根据公式M=Y×1500/4000计算单只蚊虫的总蛋白含量M(单位：mg)。该数值用于三种酶活性最终计算。3.3谷胱甘肽转移酶(GST)酶活性的测定将蚊虫酶液、GST缓冲液、1-氯-2,4-二硝基笨(cDNB)缓冲液各2000L混合加入一次性比色杯内,同时将0.25MKP04缓冲液、GST缓冲液、1-氯-2,4-二硝基笨(cDNB)缓冲液各2000L混合加入另一只一次性比色杯内作为空白对照,分别在波长为340nm的分光光度计上读取OD值4次,每次间隔2-4分钟。记录每次读取的时间和每次读取的OD值。两次OD读数之差除以间隔时间获得每分钟0D变化值。四次读数标记为1,2,3,4,按照读数4-1,4-2,4-3,3-1,3-2,2-1的顺序各自除以间隔时间得到6个数值。用实验样品的平均值减去空白对照的平均值,即获得校正后的实验样品每分钟OD变化值。然后根据每只蚊虫总蛋白含量计算出其GST酶活性值(单位：μmolcDNB/min/mgprotein)。共测得956个样本的GST酶活性。3.4单加氧酶P450酶活性的测定在一次性比色杯中加入350pL蚊虫酶液和8μL7-4-乙氧基香豆素(7EC)同时取0.25MKP04缓冲液350pL代替蚊虫酶液与8μL7EC加入另一只比色杯中作为空白对照,然后在30℃水浴培养4小时。分别加入560pL氨基乙酸缓冲液,在波长调至450nm的分光光度计上读取OD值两次。然后将实验样品将两次OD读数的平均值减去空白对照的平均值得到校正后的蚊虫酶液的OD值,再除以水浴培养的时间获得每分钟蚊虫酶液OD的变化值。所有操作重复一次。然后,取两遍操作获得的OD变化值的平均值作为该蚊虫最后的OD变化值；再根据7-3-羟基香豆素(7-HC)制定的标准曲线方程Y=88.470D+4.88计算出最后的单加氧酶P450酶活性值(单位：7-HC/min/mgprotein)。共测得938个样本的P450酶活性。3.5羧酸酯酶(COE)酶活性的测定取900pL对硝基苯基醋酸盐缓冲液放入1.5mlEP管内,30℃水浴培养5分钟,加入100pL蚊虫酶液13,000转离心5秒,转入比色杯中在分光光度计405nm波长处读取OD值,测定读取两遍,所有操作重复一次。同时将0.25MKP04缓冲液100pL代替蚊虫酶液重复上述操作获得空白对照的OD值。将然后将实验样品将两次OD读数的平均值减去空白对照的平均值得到校正后的蚊虫酶液的OD值,再除以水浴培养的时间获得每分钟蚊虫酶液OD值。所有操作重复一次。然后,取两遍操作获得的OD值的平均值作为该蚊虫最后的OD变化值。根据公式0D/(16.4X0.05×protein(mg/mL))×1000计算出最终COE酶活性值(单位：nmoL/min/mgprotein)。共测得903个样本的COE酶活性。4.海南岛主要传疟蚊媒靶标抗性测定溴氰菊酯和DDT作用的靶标为神经轴突钠离子通道,而马拉硫磷作用靶标为乙酰胆碱酯酶(AChE),因此我们对前者进行击倒抗性(Knockdownresistance,Kdr)靶标L1014位点PCR扩增验证实验,对后者进行PCR-RFLP检测Ace-1靶标G119位点基因实验。共用150只迷走按蚊、137只中华按蚊进行实验。蚊虫DNA采用专用试剂盒提取,按说明操作。4.1击倒抗性(Knockdownresistance,Kdr)靶标L1014位点验证实验Para钠离子通道具有快速击倒效应,昆虫对此产生的抗药性称为击倒抗药性(Knockdownresisters,Kdr)。按蚊最常见的是位于通道第二功能区的S6疏水区1014位点的亮氨酸突变为苯丙氨酸(LeuyPhe)、丝氨酸(serine)、半胱氨酸(cysteine)等,即L1014F、L1014S.L1014C三个位点的突变,我们重点检测L1014位点的突变。采用PCR扩增中华按蚊,其引物5’→3’为Kdr-F1023(TGCCACTCCGTGTGTTTAGA)和Kdr-R1347(GAGCGATGATGATCCGAAAT)的S6区域,目的片段大小为325bp,PCR反应条件为：反应条件为94℃C初始变性3分钟,(94℃变性1分钟,50℃复性30秒,72℃延伸30秒)×45个循环,72℃最后延伸10分钟。产物通过凝胶电泳检测并测序。迷走按蚊采用引物Agdlmi-F和Agd2h-R进行PCR扩增,反应条件仅改变复性温度50℃为47℃。4.2聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测Ace-1靶标G119区域实验PCR扩增中华按蚊和迷走按蚊G119区域,观察是否发生突变。所用引物5’→3’为Ace-1-F22F(TAGGTCACGGTGAGTCCGYA)和Ace-1-R660(ACCACGATCACGTTCTCCTC),反应条件为94℃初始变性3分钟,(94℃变性45秒,55℃复性30秒,72℃延伸30秒)×35个循环,72℃C最后延伸5分钟。2.5%凝胶电泳测得中华按蚊产物为602bp,迷走按蚊产物为571bp。所得产物继续加入AIM限制性核酸酶进行反应(按AIU1限制性核酸酶试剂盒说明书操作),若为纯合型(AGC/AGC),将得到118bp和75bp两条产物,若为野生型(GGC/GGC),只有193bp一条产物,若为杂合型(GGC/AGC),将得到193bp,118bp和75bp三条产物。根据突变个数计算突变频率。5.统计学分析所有数据采用SPSS13.0软件进行统计分析。蚊虫的死亡率根据每个蚊虫种群接触每种杀虫剂24小时后的死亡数量进行计算。以蚊虫接触无杀虫剂但有对应溶剂的空白膜为对照进行校正。将每个重复校正后的死亡率用于计算每个蚊虫种群对每种杀虫剂处理后蚊虫的平均死亡率和标准差。将每个种群每种杀虫剂处理后24小时内死亡的蚊虫分为敏感性蚊虫(敏感组S),24小时后活着的蚊虫分为抗药性蚊虫(抗性组R)。用卡方检验(Chi-square)或Fisher确切概率检验分析蚊虫抗药性与基因突变(kdr靶标L1014位点和ace-1靶标G119位点基因)的关联。用两独立样本t检验分析抗性组与敏感组蚊虫酶活性的差异。当P<0.05时有统计学意义。同时计算每个蚊虫种群对每种杀虫剂处理后获得的抗性组与敏感组蚊虫酶活性之比值(R/Sratio),抗性组与敏感组比值的标准差用下列公式计算：SD=SQRT[(SDR/MR)2+(SDs/Ms)2].二、实验结果1.海南岛主要传疟媒介种群密度及使用杀虫剂调查结果在海南岛8个点中,中华按蚊主要分布在三亚(0.923±0.280条/勺)和保亭(1.056±0.665条/勺)；棋斑按蚊主要分布在三亚(1.979±1.470条/勺)、保亭(4.572±1.855条/勺)和陵水(1.143±0.595条/勺)；迷走按蚊主要分布在海南岛北部,其中澄迈(1.363±0.980条/勺)、临高(1.012±0.595条/勺)、定安(1.275±0.175条/勺)、屯昌(1.099±0.420条/勺)和文昌(4.792±1.085条/勺)均有分布。海南岛各地杀虫剂的使用情况：除虫菊酯类如溴氰菊酯、甲醚菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯、氯氰菊酯等在采样的8个点均有使用。有机磷酸类如三唑磷等在保亭、临高、屯昌均有使用。中国政府一直禁用的有机氯类如DDT,却在保亭、定安、文昌发现使用。其他的杀虫剂如烟碱类药物吡虫啉发现在三亚、保亭、澄迈、文昌使用。2.海南岛主要传疟媒介生物学活性的测定结果因采集的按蚊幼虫孵化为成蚊数量不足,本研究根据各地样本成蚊孵化数量及各地杀虫剂使用情况,选择性的在不同的地点用不同的药膜进行了生物测定。不同地点不同药膜对照组的致死率均为0。生物学活性共测定1725个样本,各点各药膜测定结果如下：2.10.05%溴氰菊酯的测试结果中华按蚊具有初步抗性,尤其在三亚(85.78%±17.54%)、保亭(90.98%±9.39%)。在澄迈(97.87%±4.31%)、定安(100%),迷走按蚊为敏感群。棋斑按蚊也为敏感群,其中在三亚和陵水,蚊虫在0.05%溴氰菊酯测试中死亡率均为100%。2.24%DDT的测试结果中华按蚊具有抗性：三亚(78.38%±15.83%)、保亭(72.71%±21.20%)。迷走按蚊在屯昌(67.06%±7.54%)具有抗性,在澄迈(84.00%±11.68%)、定安(88.82%±10.07%)具有初步抗性。2.35%马拉硫磷测试结果迷走按蚊具有初步抗性：定安(77.29%±10.57%)、澄迈(88.87%±4.26%)、屯昌(78.86%±9.49%)。3.海南岛主要传疟媒介代谢解毒酶活性测定结果3.1谷胱甘肽转移酶(GST)酶活性测定结果GST酶对定安采集的迷走按蚊抗5%马拉硫磷的影响有统计学意义(R/S=1.1361±0.3145,t=2.806,P=0.0060),对屯昌采集的迷走按蚊抗5%马拉硫磷影响亦有统计学意义(R/S=1.1141±0.1853,t=2.501,P=0.0150)。3.2单加氧酶(P450)酶活性测定结果单加氧酶P450酶对三亚采集的中华按蚊抗0.05%溴氰菊酯影响有统计学意义(R/S=1.5391±0.8130,t=2.738,P=0.0076),单加氧酶P450酶活性对保亭采集的中华按蚊抗0.05%溴氰菊酯(R/S=1.5278±0.6072,t=2.575,P=0.0115),保亭(R/S=1.2662±0.7366,t=2.145,P=0.0346)和三亚(R/S=1.2732±0.5853,t=2.317,P=0.0226)采集的中华按蚊抗4%DDT,定安采集的迷走按蚊抗5%马拉硫磷(R/S=1.3143±0.7058,t=2.417,P=0.0175)影响具有统计学意义。3.3羧酸酯酶(COE)酶活性测定结果COE酶活性对三亚采集的中华按蚊抗0.05%溴氰菊酯(R/S=1.2580±0.3507,t=3.478,P=0.0010)影响有统计学意义。对保亭采集的中华按蚊抗0.05%溴氰菊酯(R/S=1.2738±0.4677,t=2.009,P=0.0470)影响有统计学意义。4.海南岛主要传疟媒介靶标抗性测定结果4.1击倒抗性(Knockdownresistance,KDR)靶标验证结果中华按蚊抗溴氰菊酯(三亚采集,突变频率7.5%,P=0.025<0.05),抗DDT(三亚采集,突变频率为9.5%,P=0.015<0.05)、(保亭采集,突变频率为7.8%,P=0.011<0.05)Para钠离子第二功能区的S6疏水区1014位点的亮氨酸发生突变为苯丙氨酸(L1014),中华按蚊抗DDT可能与其抗性有关。迷走按蚊未发现L1014位点突变。4.2PCR-RFLP检测Ace-1靶标G119位点基因实验我们发现迷走按蚊G119位点未发生突变,中华按蚊在各地采集的抗马拉硫磷与敏感蚊虫G119位点均有突变,突变频率在53%到72%之间,有抗性的蚊虫突变频率略高于敏感蚊虫。迷走按蚊均未发生G119位点突变。三、结论1.海南岛在7、8月间主要传疟按蚊为中华按蚊、迷走按蚊和棋斑按蚊,在海南岛南部主要传疟媒介以中华按蚊和棋斑按蚊种群为主,北部主要以迷走按蚊分布为主。除虫菊酯类杀虫剂在海南应用最为广泛。2.生物学活性测定结果表明海南岛中华按蚊(保亭和三亚)对溴氰菊酯具有初步抗性,中华按蚊、迷走按蚊对DDT具有初步抗性,迷走按蚊(澄迈、定安、屯昌)对马拉硫磷具有初步抗性。PCR-RFLP检测Ace-1靶标G119位点基因实验结果表明,中华按蚊(保亭和三亚)对马拉硫磷有初步抗性。3.海南中华按蚊和迷走按蚊代谢性解毒酶活性和分子生物学击倒抗性实验(Kdr)测试结果表明,代谢性解毒酶产生抗药性机制的在海南较为普遍。由于击倒抗性实验我们只在海南的中华按蚊中发现有L1014位点的突变,突变类型为L1014F,说明迷走按蚊的抗药性机制只与代谢性解毒酶的活性有关。而中华按蚊抗药性可能是酶生物学活性和靶标基因发生突变共同作用的结果。
【作者】秦茜；
【导师】陈晓光；
【作者基本信息】南方医科大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】传疟媒介；抗药机制；生物学活性；代谢解毒酶；击倒抗性；

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