癌基因DEK对结直肠癌生物学行为的影响及其临床意义

【摘要】研究背景：结直肠癌是消化道最常见恶性肿瘤之一,根治术后5年生存率约65%。已知增殖和转移是其主要的致死原因,因此,明确结直肠癌发生的分子机制、寻找能够有效评估患者预后的分子标志物是延长结直肠癌患者生存期的关键。癌基因DEK是一个新发现的DNA拓扑结构调节因子,位于染色体6p22.3,为高度保守的可磷酸化的核蛋白,由位于核常染色质的375个氨基酸组成,优先表达于增殖活跃的恶性细胞,在每个核内可以达到400到600万拷贝量,是一种可以影响细胞分裂、DNA修复、抑制细胞分化、老化和凋亡以及转化的致癌基因。前期研究发现,癌基因DEK在肿瘤发生发展中起重要的促癌作用,可以作为乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤的增殖检测指标及治疗靶点,但在结肠癌中的作用机制尚不清楚。研究目的：本研究通过细胞学实验研究癌基因DEK对结直肠癌细胞生物学行为的影响,初步探讨DEK基因参与结肠癌演进的分子机制；进而通过组织学实验验证DEK基因对结直肠癌预后评估的临床价值,为结直肠癌提供有效的预后评估指标及治疗靶点。材料和方法：1.细胞学实验部分：通过RT-PCR和Westernblotting方法检测DEK在不同结肠癌细胞系HCT116、HT29、SW480和SW620中的表达,并通过免疫荧光对siControl-和siDEK-SW620细胞进行染色,在共聚焦显微镜下观察DEK蛋白在SW620细胞中的定位。经siDEK转染SW620细胞后,进行MTT、细胞分子克隆等功能实验检测DEK沉默后细胞增殖能力的变化；利用Hoechst33342细胞核染色及流式细胞术检测DEK基因沉默后细胞凋亡水平的变化；再通过划痕实验检测DEK沉默后SW620细胞迁移能力的影响；通过Westernblot方法检测DEK沉默对SW620细胞中增殖、凋亡及迁移相关因子的变化；2.组织学实验部分：利用RT-PCR和Westernblot方法检测术后4例新鲜结直肠癌及其癌旁组织中DEK基因mRNA和蛋白水平的表达；免疫组化方法对109例术后结直肠癌组织及其癌旁组织、52例结直肠腺瘤组织蜡块进行DEK蛋白的检测,比较DEK蛋白表达与患者临床病理学特征的相关性,并通过生存分析验证DEK蛋白表达对临床患者预后评估的价值。结果：1.细胞学实验部分:RT-PCR和Westernblot结果显示,结直肠细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中均有DEKmRNA和蛋白的表达；免疫荧光染色表明DEK基因主要表达于SW620细胞核；MTT及细胞克隆实验显示当DEK基因沉默后(siDEK浓度为100nM),SW620细胞的增殖能力明显下降(P均<0.05)；Hoechst33342染色显示DEK基因沉默后(siDEK浓度为100nM),凋亡细胞数量明显增加,同时通过流式细胞仪检测发现siDEK主要促进细胞的早期凋亡；划痕实验表明siDEK(100nM)转染后SW620细胞的迁移能力明显下降；最后Westernblot检测结果显示,DEK会上调mutant-p53、MDM2和PARP的表达和Bcl-2/Bax的比率、抑制caspase-3和caspase-9的活性,并通过抑制E-cadherin及β-catenin的活性而增加其转移侵袭能力；2.组织学实验部分：新鲜结直肠癌组织RT-PCR和Westernblot实验显示,DEK的mRNA和蛋白水平均明显高于正常组织(P<0.01)；免疫组化结果表明,DEK蛋白在结直肠癌中的阳性率(97.2%)和强阳性率(48.6%)也均明显高于周围正常结直肠粘膜组织(阳性率33.0%,强阳性率9.2%)及良性腺瘤组织(阳性率32.7%,强阳性率13.5%)(P均<0.01),并与患者肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、浆膜浸润以及分期等临床病理学特点密切相关(P均<0.05)；生存分析发现,DEK高表达患者的无瘤生存率及5年生存率均低于DEK低表达者(P均<0.01)；DEK表达联合淋巴结转移、浆膜侵润、病理分期和CEA水平共同影响总生存率；DEK蛋白高表达是结直肠癌预后不良的独立风险因子(HR:1.805,P=0.004)。结论：DEK高表达于结肠癌的细胞及组织中；DEK促进结肠癌细胞的增殖、平板克隆形成和迁移；DEK通过抑制线粒体介导的凋亡通路,抑制结肠癌细胞的凋亡；DEK通过抑制E-cadherin/-catenin活性,促进结肠癌细胞的迁移；DEK过表达是结直肠癌患者不良预后的独立风险指标。
【作者】林黎娟；
【导师】林贞花；
【作者基本信息】延边大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】DEK；结直肠癌；增殖；凋亡；迁移；生存分析；生物标志物；

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