阳离子—氯离子联合转运蛋白抑制剂在大鼠术后疼痛模型中的镇痛作用研究

【摘要】尽管近二十年来术后疼痛治疗已经得到广泛的重视,对术后疼痛的认识和治疗有了较大的发展,包括对术后疼痛病理机制的研究、新型镇痛药物和镇痛技术的开发及利用等,但据大样品调查显示,在接受常规术后疼痛治疗的外科手术病人中仍有41%的病人在术后当天有中到重度疼痛,约14%的病人在术后第四天仍有中到重度疼痛。并且这些手术后有中到重度疼痛的病人更容易发展为慢性疼痛综合症,有报告指出,几种常见手术包括腹股沟疝、胆囊切除、乳腺、开胸、截肢术的术后慢性疼痛发生率在10%～60%。因此,术后疼痛治疗仍然是一个急待解决的重要临床问题,特别是新的不影响神志和对非痛刺激的敏感性的优秀镇痛药物的研发。目前术后疼痛治疗的不完善与我们对术后疼痛的病理生理机制了解不全面相关,因此研究术后疼痛发生机制、伤害性传导通路的可塑性、控制痛觉传导通路的敏感化、开发多模式镇痛等等具有重大意义。术后疼痛机制是独特且复杂的,有别于其它炎症、神经损伤等引起的疼痛机理,大鼠足底切口痛模型是TJ.Brennan研究组于90年代中期建立的,切开足病皮肤和深部组织、切开并牵拉肌肉,然后缝合皮肤；体感损伤与许多手术相似,切开后大鼠出现数天的对机械性刺激的痛觉过敏,然后逐渐回复,与临床术后疼痛相似,是目前广泛用于研究术后疼痛机制和治疗的较适合的动物模型。外科损伤引起两种痛觉过敏,原发性痛觉过敏和继发性痛觉过敏。原发性痛觉过敏指损伤邻近受伤害组织对热和机械刺激产生的痛觉过敏,内在机制涉及局部释放的致痛介质引起的初级传入伤害感受器的外周敏化,切开后Aδ纤维和C纤维的伤害感受器敏化,出现自发电活动、反应阈值降低、对阈上刺激的反应增强、感受野扩大、对特定刺激有反应的伤害感受器的比例增加等等。虽然炎症也参予了切开痛的机制,但与在其它组织损伤模型中所起的作用不同。大鼠足底切口痛模型中炎症因子分泌时程与机械痛觉过敏的发生并不一致,缓激肽拮抗药对切开痛亦没有止痛作用,反映与炎性痛相比术后疼痛有其独特的机制。另外,缺血因素可能在术后疼痛机制中起着重要作用,局部酸中毒与术后疼痛行为和痛觉过敏伴行；低的PH值可活化几个易转导疼痛的离子通道,如酸敏感的离子通道、辣椒素受体、嘌呤能受体和钾通道等。继发性痛觉过敏指伤口周围未受损伤的组织对机械性刺激的过敏,是中枢敏化的结果,源于背角神经元对外周传入的增强反应,其幅度和时程与组织损伤的程度相关。继发性痛觉过敏的产生和维持的机制不同,因为其由外周传入介导,但形成后独立于从伤口来的外周信号。中枢疼痛通路的敏化与兴奋性突触反应增强及抑制反应降低相关,放大了对伤害和非伤害刺激的反应。围手术期疼痛通路具有可塑性,对脊髓可塑性的更好的理解,包括兴奋性和抑制性通路,有助于我们发展选择性和有效性更好的围手术期疼痛治疗药物。“平衡镇痛”和多模式镇痛应该包括联合应用镇痛药和抗痛觉过敏药物来保障围手术期的疼痛缓解。阳离子-氯离子联合转运蛋白(CationChlorideCotransporter,CCC)是一组转运钠、钾、氯离子进出细胞的膜蛋白,发现于1980年,属SLC12(solutecarrierfamily12)基因家族。哺乳动物的CCC家族有9个成员,分别由基因SLC12a1-9编码,是表观分子量120-200kDa的糖蛋白。其中7个CCC蛋白目前描述为细胞膜离子转运蛋白,按功能分为三类：钠钾氯联合转运蛋白(NKCC1和NKCC2);钾氯联合转运蛋白(KCC1-4)；钠氯联合转运蛋白(NCC)。另外两个(CIPl/SLC12a8和CCC9/SLC12a9)的生理作用还未明确。钠钾氯联合转运蛋白1(Sodium-potassium-chlorideco-transporter1,NKCC1)亚型与钾氯联合转运蛋白2(potassium-chlorideco-transporter2,KCC2)亚型是中枢神经系统内氯离子平衡的主要调控蛋白。其中,NKCC1负责转运氯离子进入细胞内而KCC2转运氯离子到细胞外。越来越多的研究结果提示NKCC1和KCC2通过对GABA能和甘氨酸能抑制作用的影响参与了脊髓水平的疼痛传导的调控。γ-氨基丁酸(γ-amino-butylicacid,GABA)和甘氨酸(glycine)是中枢神经系统内最主要的抑制性神经递质,在控制神经兴奋性与信息加工、神经可塑性与网络同步化等方面起到相当重要的作用。在脊髓,GABA能神经元及其纤维可自成局部环路。GABA通过其受体发挥作用,其中GABAA和GABAC受体属于离子型受体,激活后成为Cl-、HCO3-的通道。GABAA受体是中枢神经系统内分布最为广泛的GABA受体,是一种配体门控离子通道受体,与C1-通道耦联,受体激活时打开Cl-通道,Cl-流动方向取决于细胞内外Cl-的浓度。在绝大部分成熟的神经元中,KCC2可以将Cl-运出细胞外,维持细胞内低浓度的Cl-,因此Cl-平衡电位(ECl)低于细胞膜电位(Vm)。GABAA受体激活后,细胞外Cl-内流,引起突触后膜超极化,由此产生一种抑制性突触后电位(Inhibitorypostsynapticpotential,IPSP)。但是在中枢神经系统发育过程中和出生后早期,未成熟神经元的细胞膜上主要表达NKCC1,而KCC2表达较弱,使细胞内聚集了高浓度的Cl-,GABAA受体激活后,细胞内Cl-外流,引起突触后膜去极化,引发一种兴奋性作用。GABA的兴奋性效应在突触形成、神经系统可塑性等方面起重要作用。甘氨酸受体(GlyR)与GABAA受体一样,同属配体门控离子通道受体,在中枢神经系统中的分布以脊髓和脑干为主。甘氨酸受体是由a、p亚单位组成的五聚体,五个亚单位共同组成Cl-通道。与GABA相似,在未成熟神经元上,甘氨酸受体激活后,Cl-通道打开,细胞内Cl-外流,引起突触后膜去极化,引发一种兴奋性作用。而在成熟神经元中,甘氨酸受体激活后,细胞外Cl-内流,引起突触后膜超极化,由此产生IPSP。因此神经细胞内氯离子浓度是决定GABA及甘氨酸介导的反应的极性的关键因素,若胞内氯离子浓度低,GABAA受体及甘氨酸受体介导氯离子内流,使细胞膜超极化,即经典的GABA介导的中枢神经元的突触后抑制；若胞内氯离子浓度高,GABAA受体及GlyR介导氯离子外流,使细胞膜去极化,正如GABA在DRG初级感觉神经元中介导的兴奋反应。而NKCC1和KCC2的表达及功能是决定神经细胞内氯离子浓度的一个关键因素,已有很多实验研究分别在各种炎症模型和神经痛模型中证明了NKCC1和KCC2蛋白对疼痛调控的影响。在辣椒素及福尔马林注射致炎性痛的大鼠模型中,鞘内注射NKCC1抑制剂布美他尼均可有效抑制疼痛行为及痛觉过敏反应；在脊髓挫伤致慢性病理性神经痛的大鼠,布美他尼可减轻疼痛行为及热刺激诱发的痛觉过敏,蛋白测定显示NKCC1在损伤后14天时呈短暂的显著增加,同时伴KCC2的表达下调。在我们的前期研究中,我们应用大鼠足底切口痛模型反映手术后疼痛,在切开前予鞘内注射呋噻米溶液,疼痛行为学测定证实其可抑制切开损伤引起的原发性和继发性痛觉过敏,提示CCC介入了术后疼痛的痛觉过敏形成机制；不过鞘内给予呋噻米后正常大鼠和足底切口痛模型大鼠均出现了短暂的兴奋性行为异常,估计与KCC2的同时被阻滞有关系。在本项研究中,我们拟通过测定足底切口痛模型大鼠的诱发及自发性疼痛行为,评估鞘内应用NKCC1高选择性抑制剂布美他尼在足底切口痛模型大鼠的镇痛效应；同时利用荧光免疫多重标记技术测定NKCC1和KCC2两个蛋白在正常和足底切口痛模型大鼠不同时间点的脊髓背角和背根节上的表达水平和分布情况,探索NKCC1和KCC2对术后疼痛的调控机制及CCC阻滞剂的作用机理,以了解选择性NKCC1抑制剂应用于术后疼痛治疗的可行性。第一部分鞘内注射布美他尼对足底切口痛模型大鼠疼痛行为的影响目的评价鞘内应用NKCC1高选择性抑制剂布美他尼对足底切口痛模型大鼠术后疼痛的镇痛效应方法成年雄性SD大鼠36只,采用T.J.Brennan研究组的方法建立大鼠足底切口痛模型,简要地,在吸入麻醉下,在左足跟部作-1cm纵向切口,包括皮肤及深筋膜,用镊子提起其下的趾短屈肌,亦纵向切开分离,然后松开,注意不能破坏肌肉起止部,随后用4–0抗菌可吸收缝线缝合皮肤两针,按压止血及清洁伤口。大鼠随机分成对照组及布美他尼组(每组N=18)进入行为学测量。对照组在切开前经鞘内注入人工脑脊液20μl,而布美他尼组注入布美他尼溶液100μg/20μl。鞘内注药在吸入麻醉下进行,参考DelaCalle等的方法,于L3-L4椎间隙用30G针头连接50μl微量注射器穿刺,出现甩尾反应后注入溶液20μl。大鼠随后分成三个亚组(每组N=6),分别接受疼痛累计评分、热痛阈及机械痛阈测定。疼痛累计评分测定方法为将大鼠置于底为8mm×8mm网格的透明塑料笼内,通过笼下的斜置的放大镜观察大鼠切开足。根据切开足承重情况给予0、1或2分,若完全负重且网格使伤口变白或扭曲则为0分,若伤口触及网格但伤口未变白或扭曲则为1分,若足部完全离开网格则为2分。每次观察时间为1min,5min重复一次,连续观察1h,12次的分数累加得出疼痛累计评分(0-24分)。热痛阈测定方法为利用热刺痛仪的辐射热源透过玻璃板照射切口旁0.5mm区域,记录从照射开始到缩足反应的时间,间隔5min重复三次,取平均值记录为热缩足反射潜伏期。机械痛阈测定方法为大鼠经过测试适应训练后,以改良的Dixonup-down法应用vonfrey丝测定大鼠的机械性撤足阈值,并计算50%缩足阈值。计算公式为50%g阈值=(10[Xf+kδ])/10000,其中Xf为最后一支vonFrey丝的压力值；k为阳性／阴性反应组合相对应的查表值,δ为所用刺激间的平均差值。大鼠分别在切开前1d、切开后2h、2d、3d、4d、5d、6d接受一次相应的疼痛行为学测定。使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。50%缩足阈值和疼痛累计评分用中位数及四分间距表示,并用非参数检验方法,组内不同时间比较用Friedman法,组间比较用Mann-Whitney法。WLT的结果用x±s表示,采用重复测量数据的方差分析,组间各时间点的比较采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果对照组及鞘内布美他尼组的疼痛累积评分在切开后均较术前显著增加(均为P<0.001),但切开后布美他尼组的评分显著低于对照组,并持续至术后第5天(P=0.004(D1),0.003(D2),0.003(D3),0.096(D4),0.007(D5),0.317(D6))。鞘内布美他尼显著增加足底切口痛模型大鼠的热痛阈(F=580.755,P<0.001)；同时不同时间的热缩足反射潜伏期有显著差异,F值为F=247.463,P<0.001；药物与时间点间交互作用无显著性,F=4.065,P=0.073。对照组及布美他尼组各时间点的热缩足反射潜伏期有显著差异,均为P<0.001。同一时间点的两组间比较,显示基础值无差异,P=0.832,而切开后第一至第六天布美他尼组的热缩足反射潜伏期均显著大于对照组,均为P<0.001。对照组和布美他尼组的50%缩足机械阈值在切开后2h至第六天均显著低于基础值(P值均<0.001),两组间基础阈值无差异(P=0.902),但从切开后2h至第五天,布美他尼组的50%缩足阈值显著高于对照组(P=0.003,0.003,0.002,0.026,0.022)。结论在大鼠足底切口痛模型,鞘内应用高选择性NKCC1阻滞剂布美他尼可降低术后的疼痛累积评分、提高术后热痛阈及机械痛阈,说明鞘内注射布美他尼可有效减轻术后静息痛及诱发痛,有希望成为新的术后疼痛治疗策略。第二部分足底切口痛模型大鼠背根节及脊髓背角NKCC1和KCC2表达的变化目的测定足底切口痛模型大鼠背根节和脊髓背角的NKCC1和KCC2蛋白表达及其变化方法成年雄性SD大鼠30只,随机分成对照组、切开后2h、2d、3d、6d组(每组N=6)。采用T.J.Brennan研究组的方法建立大鼠足底切口痛模型,在吸入麻醉下,在左足跟部作一1cm纵向切口,包括皮肤及深筋膜,用镊子提起其下的趾短屈肌,亦纵向切开分离,然后放松,随后用4-0抗菌可吸收缝线缝合皮肤两针,按压止血及清洁伤口。切开后在预定时间进入免疫组化程序,简略地,在戊巴比妥钠深麻醉下,经升主动脉先后灌注4℃PBS液及4%多聚甲醛缓冲液(pH7.3),随后取出L4-L5节段脊髓及双侧L5背根节(DRG)。DRG后固定25min,脊髓后固定14h；其后经10%、20%、及30%蔗糖PBS梯度脱水。五组样本用OCT液包埋于一个样本头,冰冻切片(16μm厚)后贴片,进入NKCC1或KCC2免疫染色程序。切片用5%ChemiBLOCKERTM(Millipore2170,USA)加0.5%TritonX100PBS室温下封阻1h；然后DRG于室温下与一抗(山羊抗;NKCC1,SantaCruz,#sc-21545;山羊抗KCC2,SantaCruz,#sc-19420;1:20)孵育2h,脊髓组织则用相同抗体(1：100)在4℃下孵育两晚；PBS洗片后,加入二抗(FITC标记驴抗山羊IgG,JacksonImmunoResearch705-095-003,1:200),避光室温下孵育90min,最后10min加DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylin.dole,0.3染核。Leica荧光显微镜下阅片、照相,专人行全背角及全DRG阳性细胞计数。使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。实验数据以x±s表示,组间阳性细胞数的比较采用完全随机的单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐性检验用Levene检验,方差不齐则选择Welch近似方差分析。多重比较用LSD法(Levene’sposthoctest)或Tamhane’sT2法,P<0.05为差异有统计学意义。结果NKCC1在正常大鼠DRG内表达微弱,切开后双侧DRG均见NKCC1表达增加,以切开侧更明显,NKCC1免疫活性增加主要在神经元细胞膜上；各时间组阳性细胞计数有统计学差异(F=10.848,P=0.001),2h组的阳性细胞与对照组比较差异有统计学意义(P=0.001)。KCC2在正常及足底切口痛模型大鼠DRG内均未见表达。NKCC1在正常大鼠脊髓背角深层微弱表达,切开后同侧背角深层NKCC1表达显著增加(F=219.996,P=0.000),切开后2h、2d、3d、6d组的阳性细胞与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.004,0.000)。KCC2在正常大鼠的脊髓背角深层有显著表达,在胶状质层有微弱表达；切开后KCC2在同侧背角深层表达降低(F=14.634,P=0.000),2h,2d,3d,6d组的阳性神经元计数显著减少(P=0.003,0.000,0.002,0.004)。结论NKCC1表达在正常大鼠的DRG及脊髓背角深层；KCC2表达在正常大鼠的脊髓背角,以深层为主。在大鼠足底切口痛模型,NKCC1在脊髓水平的表达上调,KCC2在脊髓背角深层的表达下调,提示NKCC1及KCC2参与了术后疼痛及痛觉过敏形成机制,可能成为术后疼痛治疗的新的靶点。第三部分NKCC1和KCC2在足底切口痛模型大鼠背根节和脊髓背角的A纤维及C纤维传入神经元内的表达目的明确NKCC1和KCC2在足底切口痛模型大鼠DRG及脊髓背角的C纤维和A纤维传入神经元内的表达方法成年雄性SD大鼠30只,随机分成对照组、切开后2h、2d、3d、6d组(每组N=6)。采用T.J.Brennan研究组的方法建立大鼠足底切口痛模型,在吸入麻醉下,在左足跟部作-1cm纵向切口,包括皮肤、筋膜,切开并分离趾短屈肌,随后缝合皮肤两针,按压止血及清洁伤口。切开后在预定时间进入免疫组化程序,简略地,在戊巴比妥钠深麻醉下,经升主动脉先后灌注4℃PBS液及4%多聚甲醛缓冲液(pH7.3),随后取出L4-L5节段脊髓及双侧L5背根节(DRG)。DRG后固定25min,脊髓后固定14h；其后经10%、20%、及30%蔗糖PBS梯度脱水。五组样本用OCT液包埋于一个样本头,冰冻切片(16μm厚)后贴片,进入多重染色免疫组化程序。参照Funk等的方法,切片用5%ChemiBLOCKERTM(Millipore2170,USA)加0.5%TritonX100PBS室温下封阻1h；然后DRG于室温下与一抗孵育2h,脊髓组织则用相同抗体在4℃下孵育两晚；使用以下抗体组合及最终稀释度：山羊抗NKCC1(SantaCruz,#sc-21545)、山羊抗KCC2(SantaCruz,#sc-19420),DRG用1：20稀释度,脊髓用1：100稀释度；兔抗神经丝蛋白200(NF200)(Sigma,N4142),稀释度1：400。PBS洗片三次后,与相应的荧光标记二抗组合室温下避光孵育60min。所用荧光二抗包括：FITC标记驴抗山羊IgG(JacksonImmunoResearch705-095-003,1:200),AMCA标记驴抗山羊IgG(JacksonImmunoResearch705-155-147,1:300),TRITC标记驴抗兔IgG(JacksonImmunoResearch711-025-152,1:300),FITC标记凝集素B4(SigmaL2895,3.3μg/ml),及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,5μg/ml)。避光下PBS洗片四次、风干、抗荧光衰减封片剂封片后,应用配LeicaDFC425CCCD摄像头及LeicaLAS软件的荧光显微镜阅片、照相。一抗的预吸收对照及省略一抗的切片未见荧光出现。结果在切开后2天的大鼠DRG的NKCC1和DAPI双染切片上,显示绝大部分神经元细胞膜上清晰的NKCC1表达。DRG切片的NKCC1和C纤维传入神经元标记物IB4双染,显示绝大部分C纤维传入神经元上有显著的NKCC1表达。DRG切片的NKCC1和A纤维传入神经元标记物NF200双染,显示大部分A纤维传入神经元上有明显的NKCC1表达。脊髓切片的NKCC1和A纤维传入神经元标记物NF200双染,显示背角深层和Ⅰ层的绝大部分A纤维传入神经元有显著的NKCC1表达。脊髓背角切片的NKCC1和IB4双染显示,在正常大鼠脊髓背角,NKCC1阳性信号主要在深层,IB4阳性信号集中在胶状质层,在胶状质层仅有微量的共染；在切开后大鼠,NKCC1阳性信号在深层和浅层均有明显增加,在胶状质层可见明显的共染信号。脊髓背角的KCC2和NF200双染显示,背角深层部分A纤维传入神经元有显著的KCC2表达。正常大鼠脊髓切片的KCC2和C纤维传入神经元标记物IB4双染,显示背角深层显著的KCC2表达和浅层少量的KCC2表达；IB4仅在胶状质层显著表达；在胶状质层可见KCC2和IB4共染信号。结论NKCC1表达在DRG的A、C纤维传入神经元和脊髓背角的A纤维传入神经元内；KCC2表达在部分背角深层A纤维传入神经元内,及少量表达在胶状质层C纤维传入神经元内；提示NKCC1和KCC2参与了脊髓对多种信号传入的调控及痛觉过敏和痛觉超敏的形成。
【作者】何雁冰；
【导师】徐世元；
【作者基本信息】南方医科大学，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】镇痛；钠钾氯联合转运蛋白1(Sodium-potassium-chlorideco-transporter1；NKCC1)钾氯联合转运蛋白2(potassium-chlorideco-transporter2；KCCT)布美他尼；足底切口痛模型；术后疼痛；

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