新发现的水禽星状病毒、微RNA病毒和嵌杯病毒的分子检测与鉴定

【摘要】近20年来,新的水禽疫病不断出现,对我国水禽业构成了巨大威胁。因此,筛查水禽群体中可能存在的新病毒对于水禽新现疾病的防控具有十分重要的意义。2011-2012年间,从我国四个省采集水禽样品155份,包括来自江西的2月龄健康朗德鹅粪便样品19份和健康麻鸭粪便样品18份、来自广东和湖北的活禽市场采集的北京鸭粪便样品90份以及从山东采集的出壳前死亡北京鸭胚的肠道样品28份。利用星状病毒ORF1b通用引物进行RT-PCR检测,检出阳性样品20份(12.9%)。对扩增产物的序列进行比较分析的结果显示,20株星状病毒分属两类(A和B),彼此间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55%-58%和57-59%,它们与已知禽星状病毒的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为52%-72%和35-79%。进化分析进-步证实,这些毒株均不同于已知的禽星状病毒,属于两类新的星状病毒。A类星状病毒共7株,均来白广东的北京鸭；B类星状病毒包括来自广东的北京鸭源毒株1株、从山东的北京鸭胚中检出的毒株3株、来自江西的麻鸭源毒株2株和朗德鹅源毒株7株。这些结果表明,星状病毒感染的地区分布已很广泛,且至少有三种水禽可感染星状病毒。研究结果还表明,两类星状病毒感染水禽后均可经粪便排毒,其中B类星状病毒具有较广泛的宿主范围。在部分ORF1b区,B类毒株与本室最近检出的鸭星状病毒(duckastrovirus,DAstV)CPH株具有相近的遗传进化关系,其核苷酸与氨基酸序列同源性分别达95%-96%和97-99%,表明它们属于同一个类型,因此,从A类中选DAstV/YP2株,用随机扩增、RT-PCR、5’RACE和3’RACE技术测定了其基因组序列。序列分析表明,不计poly(A)尾,DAstV/YP2基因组长度为7287nt,由12nt的5’UTR、3363nt的ORFla、1545nt的ORF1b、2184nt的ORF2和177nt的5’UTR组成。结果表明,DAstV/YP2具有典型的星状病毒基因组结构。用三个蛋白的全长氨基酸序列进行同源性分析和进化分析的结果表明,DAstV/YP2与已知的禽星状病毒具有较远的遗传进化关系。在衣壳蛋白区,DAstV/YP2与已知的禽星状病毒之间的遗传距离为0.599-0.801,据此可将DAstV/YP2鉴定为星状病毒科禽星状病毒属的一个新病毒种。采用不依赖序列的随机扩增法,并经测序和序列相似性检索,从一份来自广东的北京鸭粪便样品检测到一种新的微RNA病毒(LY株)。随后,采用RT-PCR、5’RACE和3’RACE技术测定了该病毒的基因组序列。序列同源性和进化分析结果表明,该病毒LY与微RNA病毒科Megrivirus属成员间的遗传进化关系最近,在P1、P2、P3、polyprotein和2C+3CD区,该病毒与Megrivirus成员间的氨基酸序列同源性分别为32-68%、35-45%、51-57%、41-50%和61-63%,据此将该病毒鉴定为Megrivirus属内的一个新成员,暂称之为Duckmegrivirus(DMV)。序列分析表明,DMV具有类似于MeV-A的基因组结构,但亦有自身的特点。不计poly(A)尾,DMVLY株基因组长度为9700nt,是微RNA病毒科中最长的。最显著的特点位于2A区,该区由两个功能未知的蛋白(2A1和2A2)以及一个parachovirus样的2A3组成。DMV的5’UTR所含内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)属于IVBIRES的变异型,即其Ⅲ域含有一个很长的Ⅲ4螺旋,且Ⅲ域的顶端是一个20-nt长的“8”样保守结构。比较分析显示,所预测的DMVIRESⅢ域的二级结构亦见于MeV-A、Mesivirus、鹌鹑微RNA病毒和鸽子微RNA病毒B。以往在IVA和IVC型IRES的、域所见到的保守的内部和顶环在DMVIRES的Ⅱ域高度保守。另外,在不同的基因区,DMV分别与Megrivirus属的两个成员具有相近的遗传进化关系。这些结果表明,在进化过程中,DMV的编码区和非编码区可能发生过基因重组。为了解DMV感染的流行情况,检测了2011-2012年间从山东、广东、湖北和海南采集的另外117份北京鸭样品,从4个地区的样品中均检测到DMV,阳性率为23.9%,结果表明,我国鸭群中DMV的感染率较高,且地区分布较广。采用上述方法,从一份来自江西的朗德鹅粪便样品检测到一种嵌杯病毒。随后,采用RT-PCR.5’RACE和3’RACE技术测定了该病毒的基因组序列。序列分析表明,鹅嵌杯病毒(Goosecalicivirus,GoCV)基因组全长8103nt,编码2个ORF,即ORF1和ORF2,这两个ORF位于同一个读框,间隔3nt,这一特性与火鸡嵌杯病毒(Tukeycaliivirus,TuCV)类似。长度为6960-nt的ORF1编码一个大的聚蛋白,预测该聚蛋白裂解为非结构蛋白Nterm、NTPase、3A、VPg和Pro-pol以及主要结构蛋白VP1；长度为825-nt的ORF2编码次要结构蛋白VP2。结果表明,GoCV拥有类似于TuCV的基因组结构。与其他嵌杯病毒的比较结果表明,在非结构蛋白、VP1和VP2区,GoCV与TuCV的氨基酸序列同源性最高,分别为62%、38%和52%。进化分析表明,GoCV与TuCV具有相近的遗传进化关系,但亦存在明显的区别,因此,将GoCV鉴定为嵌杯病毒科”Nacovirus”属内的一种新病毒。
【作者】廖勤丰；
【导师】张大丙；
【作者基本信息】中国农业大学，预防兽医，2014，博士
【关键词】星状病毒；鸭星状病毒；微RNA病毒；鸭微RNA病毒；嵌杯病毒；鹅嵌杯病毒；

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