唑来膦酸辅助治疗骨巨细胞瘤的基础研究与临床新方法的初步应用

【摘要】[背景]骨巨细胞瘤是常见的原发性骨肿瘤之一。多数研究者认为其为一种来源于骨髓间充质干细胞的良性骨肿瘤,以局部骨质破坏为主要特征,其中少数病例还可发生“良性”肺转移。目前研究显示,骨巨细胞瘤对传统的放疗及化疗不敏感,手术治疗仍然是骨巨细胞瘤最主要的治疗方式。术后高复发率是骨巨细胞瘤治疗最大的挑战。为手术彻底清除肿瘤病灶,临床医生曾经尝试在术中使用多种化学试剂或物理方法辅助治疗,进行病灶刮除术后囊壁的处理,清除残留的肿瘤细胞,从而减少骨巨细胞瘤的复发。病灶刮除囊壁高速磨除加骨水泥填充目前被认为是骨巨细胞瘤手术治疗的标准方式。随着对骨巨细胞瘤疾病的深入研究,双膦酸盐类及RANK单克隆抗体辅助治疗成为近年来骨巨细胞瘤治疗的新进展。双膦酸盐早期是作为一类抗代谢骨病药物进入市场,它通过与焦磷酸的类似结构,发挥抗骨吸收的作用。在临床应用于骨巨细胞瘤辅助治疗的研究中,取得了良好的效果。在体外实验研究中,人们发现双膦酸盐类不仅可抑制破骨细胞介导的骨吸收,延缓破骨细胞生成和成熟并诱导破骨细胞凋亡,而且能够直接作用于肿瘤细胞而发挥抑制肿瘤的作用。我们在对新一代双膦酸盐药物唑来膦酸对骨巨细胞瘤基质细胞的直接作用的研究中观察到,其不仅诱导肿瘤细胞凋亡,还可诱导肿瘤细胞的成骨分化,通过这两种方式而发挥显著的抗肿瘤作用。这一结论也解释了临床上报导的双膦酸盐辅助治疗骨巨细胞瘤后病灶周围明显骨化形成的现象,也为骨骼相关事件的降低提供理论依据。在证实双膦酸盐具有诱导骨巨细胞瘤肿瘤细胞分化这一重要的抗肿瘤方式后,进一步研究双膦酸盐的浓度及诱导作用时间与其成骨诱导效应的相关性可能具有重要的临床意义。在分子生物学水平深入探索双膦酸盐如何通过激活信号通路而诱发骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化,也将为人们更进一步了解其生物学规律并促进其抗肿瘤效应具有重要意义。此外,目前临床医生尝试了双膦酸盐辅助治疗骨巨细胞瘤的不同途径和方式,我们也报道了常规术后双膦酸盐静脉辅助治疗方式的疗效。根据手术治疗骨巨细胞瘤的特点,寻找更加安全有效的辅助用药途径和方式,也将可能对提高肿瘤的疗效发挥重要的意义。[目的]1)探讨唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的最佳浓度及作用时间。2)探讨唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化机制。3)探讨临床上应用双膦酸盐类辅助治疗骨巨细胞瘤的新方式及可行性。[方法]1)唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的浓度及时间相关性实验研究。实验标本来自2011年11月至2013年1月广州军区广州总医院及南方医科大学附属南方医院收治的4例四肢骨巨细胞瘤患者。其中男性1例,女性3例,年龄13～31岁。肿瘤影像学分级按Campanacci分级标准,其中Ⅱ级3例,Ⅲ级1例。所有患者术前均未接受双膦酸盐药物辅助治疗,术后均经过病理诊断为骨巨细胞瘤。对术中切除的骨巨细胞瘤新鲜组织进行原代培养,待骨巨细胞瘤细胞经9次传代纯化后分别给予含有不同浓度唑来膦酸(0μM,0.01μM,0.1μM,1μM,5μM,30μM)培养基培养,处理72小时后,采用qRT-PCR方法检测各组骨巨细胞瘤基质细胞成骨相关基因cbfa-1、osterix、osteocalcin表达。应用SPSS19.0统计学软件将各组cbfa-1、osterix、osteocalcin的基因表达值进行单因素方差分析(one-wayANOVA)分析,组间多重比较采用LSDtest。再采用1μM唑来膦酸与空白对照培养基分别行骨巨细胞瘤基质细胞培养,处理48小时后,给予细胞爬片ALP染色及BSP、CollagenTypeI、Osteonectin、Osteocalcin细胞免疫染色检测。另于诱导后0小时、24小时、72小时及168小时行qRT-PCR方法检测两组骨巨细胞瘤基质细胞cbfa-1、osterix、osteocalcin的基因表达。统计结果,分析唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的最佳浓度及作用时间。2)唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的信号途径实验研究。取原代培养并已纯化的骨巨细胞瘤基质细胞,随机分组为对照组,诱导组和信号抑制组1,2,3。对照组采用常规培养液,诱导组加入1μM浓度的唑来膦酸,信号抑制组1和2在加入唑来膦酸前2h加入JNK信号抑制剂SP600125(1μM)和ERK信号抑制剂PD98059(20μM),抑制组3同时加入SP600125及PD98059。处理30分钟后,采用Western印迹杂交检测p-JNK,JNK,p-ERK,ERK蛋白质在各组骨巨细胞瘤基质细胞内的表达。采用同样的实验分组的处理方法,72小时后,采用qRT-PCR方法检测各组细胞cbfa-1、osterix、osteocalcin的基因表达。统计学方法同前。分析双膦酸盐是否通过激活JNK和ERK通路(即信号通路的磷酸化)发挥成骨分化诱导作用。3)双膦酸盐辅助治疗骨巨细胞瘤新方式的可行性探索。数字化复合抗骨巨细胞瘤珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸(CHA/PLA)人工骨的制备及性能探索：首先利用计算机辅助3D打印将按一定比例混合的CHA粉末与聚乳酸(PLA)制作成具有特定外形珊瑚羟基磷灰石/聚乳酸人工骨支架,通过浸泡后真空冻干燥等处理将唑来膦酸钠载入。将复合人工骨支架浸入细胞培养液,收集6h、12h,24h、48h及72h浸提液。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)及Annexin-VFITC流式细胞定量分析法检测不同时期浸提液对骨巨细胞瘤基质细胞的增值影响及凋亡诱导作用。分析局部使用双膦酸盐的有效性。采用局部灌洗法辅助治疗骨巨细胞瘤1例的观察：广州军区广州总医院1例左股骨下段骨巨细胞瘤复发患者,给予再次囊内病灶刮除骨水泥填充手术,术中采用唑来膦酸溶液(2mg/500ml)局部冲洗,术后48小时内给予病灶内唑来膦酸溶液(2mg/500ml)局部灌洗引流。观察患者一般情况,切口引流及愈合情况。术后定期病情复查。初步观察局部灌洗法可能存在的安全性。通过双膦酸盐的临床新方法的初步应用观察,探索其不同应用方式的可行性,为进一步大样本临床应用和疗效观察提供指导。进一步促进骨巨细胞瘤的治疗效果。[结果]1)唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的浓度及时间相关性实验研究。实验显示1μM唑来膦酸组中成骨分化相关基因表达最明显。48小时后1μM唑来膦酸组cbfa-1、osterix、osteocalcin的基因表达分别是对照组2.66倍、2.50倍及2.23倍,具有统计学显著性差异(P=-0.002,<0.001,<0.001)。此外,0.1μM唑来膦酸组cbfa-1基因表达是对照组1.6倍,具有显著性差异(P=0.003)。在唑来膦酸诱导48小时后骨巨细胞瘤基质细胞ALP染色及BSP、CollagenTypeI、Osteonectin、Osteocalcin免疫组化染色与对照组相比表现为轻度阳性或阳性。在诱导后24小时,诱导组cbfa-1的基因表达与对照组具有显著性差异(P<0.001)；在72小时监测点,诱导组与对照组osterix、osteocalcin的基因表达均具有显著性差异(P=0.001,0.003)；在168小时监测点,诱导组与对照组cbfa-1、osterix、osteocalcin的基因表达分别增高8.1,3.8及3.3倍,均具有显著性差异(P=0.002,0.002,0.002)。2)唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的信号途径实验研究。采用了Western印迹杂交检测ERK,JNK,p-ERK,p-JNK蛋白质在各组骨巨细胞瘤基质细胞内的表达。唑来膦酸组内可见ERK,JNK,p-ERK,p-JNK明显表达。同时加入两组阻断剂后JNK及ERK蛋白表达明显降低。在处理72小时后,单纯1μM唑来膦酸诱导组组osteocalcin的基因与对照组及信号抑制组1,2,3均具有统计学显著性差异(P<0.001,=0.007,<0.001),cbfa-1基因与对照组及信号抑制组1,3具有统计学显著性差异(P).013,0.008)。唑来膦酸诱导组cbfa-1、osterix、osteocalcin的基因表达分别是SP600125+PD98059抑制组的5.01、3.54、3.39倍。Cbfa-1,osterix、osteocalcin的基因表达信号抑制组1,2,3与对照组无统计学显著性差异(P>0.05)。Osterix的基因表达中,1μM唑来膦酸诱导组与对照组无显著性差异(P=-0.213)；但与cbfa-1、osteocalcin存在显著性差异(P=0.048,0.005)。3)双膦酸盐辅助治疗骨巨细胞瘤基质细胞新方式的可行性探索。3D打印技术可制备个体化复合抗骨巨细胞瘤珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸(CHA/PLA)人工骨。制备材料经过72小时、48小时、24小时、12小时及6小时后提取浸提液,在原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞中予不同时期的复合唑来膦酸人工骨浸提液,48小时后,见细胞数量较阴性对照组减少,部分细胞形态发生变化,细胞外形发生皱缩,伪足减少,部分梭形基质细胞改变为圆形或椭圆形的形状,在早期的浸提液中最为明显。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测不同时期浸提液对骨巨细胞瘤基质细胞的增值影响,结果显示复合唑来膦酸人工骨浸提液对骨巨细胞瘤基质细胞抑制较阴性培养基对照组显著增强。48小时内早期高浓度唑来膦酸浸提液对骨巨细胞瘤基质细胞增殖具有明显抑制作用,与对照组浸提液有显著性差异(P<0.001,0.001,0.001,=0.002)。48小时后浸提液抑制作用减弱,并与前24小时有显著性差异(P=0.007,0.005,0.004)。复合唑来膦酸人工骨浸提液同样表现出很强的的诱导凋亡的能力,Annexin-VFITC凋亡染色及流式细胞仪定量分析结果显示对照组、72小时、48小时、24小时、12小时及6小时浸提液组原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞凋亡占总数细胞的百分比均值依次为1.5%、2.05%、3.3%、5.23%、8.95%及12.79%。局部唑来膦酸灌洗法预防骨巨细胞瘤复发安全性的病例观察：术中多功能引流管置于病灶周围。术后灌洗引流管引流通畅,总引流液约900m1。术后48小时拔出引流管。患者未发生流感样症状及肾功能异常。12天后手术切口拆线,愈合状况良好。唑来膦酸溶液局部灌洗治疗随访未发现明显相关并发症。[结论]1)双膦酸盐对骨巨细胞瘤基质细胞具有诱导凋亡及成骨分化的双重作用。其作用方式可能于药物浓度相关,低浓度唑来膦酸可能具有较强的骨巨细胞瘤基质细胞成骨诱导潜能,促进肿瘤细胞向正常细胞分化。在体外实验中,1μM浓度唑来膦酸具有最强的诱导分化能力。因此,维持低剂量唑来膦酸辅助治疗骨巨细胞瘤能够诱导残留肿瘤基质细胞分化,避免了骨巨细胞瘤手术中不必要的切除,促进病灶周围骨结构的强化或重建,减少术后骨折等并发症,还可能减少高浓度辅助用药的全身性副作用。2)唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞成骨分化呈时间依赖性,诱导时间越久骨巨细胞瘤基质细胞成骨分化现象越明显。临床双膦酸盐类药物的使用较方便,可定期静脉或口服用药。在避免发生重大并发症的基础上,围手术期可维持低剂量唑来膦酸治疗,发挥持续抗肿瘤作用。辅助治疗时间越久,术后肿瘤复发率可能越低。3)JNK和ERK信号通路在成骨细胞分化及生长增殖等多种生理过程发挥重要作用。实验证明唑来膦酸也可能激活JNK和ERK蛋白磷酸化,阻断JNK和ERK信号通路能够降低唑来膦酸诱导成骨相关基因的表达,因此唑来膦酸可能是通过JNK和ERK信号通路的激活来诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化。通过对骨巨细胞瘤基质细胞成骨分化机制的深入研究,为新型辅助用药的使用及提高成骨诱导效应提供新途径。4)数字化复合抗骨巨细胞瘤珊瑚羟基磷灰石/聚乳酸(CHA/PLA)人工骨可为骨巨细胞瘤病灶清除术后的骨质缺损提供个性化支撑,其制作方便快捷。同时,唑来膦酸在洗脱支架周围局部释放,早期可提高局部药物浓度,对残留骨巨细胞瘤基质细胞发挥凋亡诱导作用。随着唑来膦酸药物降低,可持续发挥抗骨质吸收及促进肿瘤基质细胞成骨诱导作用,促进病灶内骨结构的强固或重建,减少骨折等并发症的发生率。局部使用数字化人工骨复合唑来膦酸为骨巨细胞瘤辅助治疗提供一种可能的有效治疗途径。5)骨巨细胞瘤的复发给患者带来极大的痛苦。在1例骨巨细胞瘤复发后再次行病灶清除术,并且在囊内采用唑来膦酸溶液冲洗及留置唑来膦酸术后灌注方式,希望残留肿瘤细胞的清除更加可靠。这一局部辅助治疗方式既往未见报道。本病例观察见切口引流未见明显影响。患者未出现流感样症状及肾功能异常等系统性并发症。手术切口愈合良好。局部唑来膦酸灌注的使用方式,为骨巨细胞瘤辅助治疗提供一种可能的安全治疗手段,其有效性及安全性仍需要进一步的临床研究。
【作者】杨涛；
【导师】尹庆水；
【作者基本信息】南方医科大学，骨外科学，2014，博士
【关键词】骨巨细胞瘤；双膦酸盐；唑来膦酸；成骨诱导MAPK；信号转导；骨组织工程；

【参考文献】
[1]叶陈勇.投资者情绪对金融风险度量的影响[D].浙江工商大学,金融学,2012,硕士.
[2]张贤昊.视觉强化对二语词汇习得的影响研究[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[3]谭玲玲.滇西地区翼状胬肉分布特点及证型/年龄/性别相关性和复发性研究[D].成都中医药大学,中西医结合基础,2012,硕士.
[4]任云童.小学高年级语文习作教学方法研究[D].东北师范大学,教育,2012,硕士.
[5]吴媛.昆明市社区居家养老服务研究[D].内蒙古大学,行政管理,2014,硕士.
[6]王伟.基于矢量水听器的目标方位估计[D].西北工业大学,水声工程,2004,硕士.
[7]李克敏.颗粒增强铜基自润滑材料的制备及其载流摩擦磨损性能研究[D].河南科技大学,材料学,2014,硕士.
[8]许天红.网络零售企业经营模式研究[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2014,硕士.
[9]陈欢.耳体针结合治疗腰椎间盘病变随机对照研究[D].北京中医药大学,针灸推拿学,2014,硕士.
[10]沈鹏程.呼吸机用无位置传感器无刷直流电机控制系统设计[D].湖南大学,软件工程,2011,硕士.
[11]汪喆.我国财政赤字和经济增长关系研究[D].安徽大学,财政学,2013,硕士.
[12]侯雪岩.严羽对前后七子诗学观的影响[D].辽宁大学,文艺学,2012,硕士.
[13]吕向阳.我国信访制度研究[D].内蒙古大学,公共管理,2013,硕士.
[14]李昕卓.几种求解Fisher-Kolmogorov方程的有限差分方法[D].吉林大学,计算数学,2013,硕士.
[15]李三新.cmf创造产品完美用户体验[J].设计,2014,12:114-116.
[16]韩思亮.基于直流变换器的逆变器拓扑和滑模控制技术研究[D].浙江大学,2005.
[17]林正.赴巴西、加拿大城市公共交通考察报告[J].城市公共交通.2002(01)
[18]赵熙,叶龙.企业知识型员工心理契约违背产生机理与消解[J].江西社会科学,2015,02:225-230.
[19]姚钰莹.基于综合利用的新安煤矿绿色矿山建设研究[D].中国地质大学（北京）,资源管理工程,2013,硕士.
[20]秦泓洋.ISP融合型内容分发网络节点部署机制研究与实现[D].哈尔滨工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[21]吕真钰.城市社区卫生服务建设中的政府责任研究[D].青岛大学,行政管理,2012,硕士.
[22]高鸿雁.基于GIS的水环境评价决策支持系统[D].沈阳工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[23]邹静昭.运用信息技术整合健康评估课程的教学设计[D].河北师范大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[24]王武祥.推广透水性地面改善住区生态环境[J].住宅产业.2004(09)
[25]齐宝利.基于WEB的CAD/CAM系统协同工作关键技术研究与实现[D].南京航空航天大学,航空宇航制造工程,2004,硕士.
[26]张钦钦.土地信息整合与空间数据挖掘研究[D].山东师范大学,土地资源管理,2013,硕士.
[27]孙雁涛.快速底盘圆形坑槽铣刨车铣刨装置设计及负载理论研究[D].长安大学,机械工程（专业学位）,2014,硕士.
[28]黄辉.可见光相机调光调焦图像处理算法研究[D].中国科学院研究生院（光电技术研究所）,信号与信息处理,2014,硕士.
[29]张红敏.财务重述与公司治理的关系研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[30]来有文.西藏卫生资源配置与利用分析及评价研究[D].山东大学,社会医学与卫生事业管理,2014,博士.
[31]孙振亚.高校建筑的复合化设计研究[D].北京建筑大学,建筑学,2013,硕士.
[32]陈钧.咪唑啉类、硫脲类、胺类以及胺基膦酸类有机缓蚀剂的构效关系研究[D].西北大学,化学工程（专业学位）,2012,硕士.
[33]杨通辉.基于节点属性变化的动态社会网络划分研究[D].山东师范大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[34]王刚.路面病害光学无损检测技术[D].南京理工大学,2007.
[35]余之泳,王浩藩,黄晓曦.双导向镗杆回转误差自动补偿技术(四)——双导向镗杆回转运动误差分析及镗孔同轴度误差的数学模型[J].组合机床与自动化加工技术.1990(10)
[36]寇冠军.乳糜泻在我国肠易激综合征病人中发病率的研究[D].山东大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[37]吴天涵.基于学龄前儿童心理特征的书籍装帧研究[D].南昌大学,设计艺术学,2012,硕士.
[38]吕敏.宽带卫星通信系统ATM/IP转换器的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2011,硕士.
[39]易海琼,杜兆斌,程时杰,张尧,侯云鹤,石立宝,倪以信.互联系统长期动态仿真的结构保留建模[J].电力系统自动化,2007,22:21-26.
[40]彩霞.高密度电子封装可靠性研究[D].中国科学院研究生院（上海微系统与信息技术研究所）,2002.
[41]黄菲菲.大比例尺地形图制图综合缩编系统设计与实现[D].浙江大学,2013.
[42]林今,孙元章,P.SФRENSEN,李国杰,程林,黎雄.基于频域的风电场功率波动仿真(一)模型及分析技术[J].电力系统自动化,2011,04:65-69.
[43]廖建华.A公司营销方案管理品质提升研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[44]朱长友.血浆N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）水平与冠状动脉病变程度的相关研究[D].山东大学,心血管病（专业学位）,2013,硕士.
[45]孙修贵.中国气象系统卫星通信专用网[J].世界电信.1998(02)
[46]颜彤彤.A型肉毒毒素对挛缩性瘢痕的治疗及机理研究[D].中国人民解放军医学院,整形外科,2013,硕士.
[47]王好好.中国当代儿童剧创作的“去成人化”研究[D].苏州大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[48]周洁.鄱阳湖生态经济区国家战略背景下江西农产品市场竞争力研究[D].江西农业大学,农业经济管理,2012,硕士.
[49]王加玉.鞘内注射CatS抑制剂LHVS缓解大鼠骨癌痛[D].苏州大学,麻醉学,2013,硕士.
[50]刘建全,孙保民,张广才,白涛,寿兵,胡永生.1000MW超超临界旋流燃烧锅炉稳燃特性数值模拟与优化[J].中国电机工程学报,2012,08:19-27+144.