胃癌腹膜转移相关蛋白Myosin-9促进胃癌的侵袭和转移

胃癌腹膜转移相关蛋白Myosin-9促进胃癌的侵袭和转移

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-22 分类:参考文献 喜欢:1345
师大云端图书馆

【摘要】胃癌是消化道常见恶性肿瘤之一,近年来随着早期诊断、胃癌根治术和新辅助放化疗等的发展,其预后有所改善,但其死亡率仍居恶性肿瘤死亡率的前列。影响胃癌预后的因素有很多,其中腹膜转移在胃癌的复发和转移中十分常见。胃癌腹膜转移常合并有顽固性腹水和粘连性肠梗阻等症状,促使患者短期内死亡。因此,如何有效的预测与控制腹膜转移是目前提高进展期胃癌疗效的关键问题之一。目前临床上用于胃癌腹膜转移早期诊断的方法主要包括腹腔液细胞学检查和分子标志物检查等。腹腔液细胞学检查是目前胃癌腹膜亚临床转移早期预测的最常用方法和金标准,但是其敏感性较低,因为并非所有浸透浆膜的进展期胃癌均能检测出腹膜脱落癌细胞。目前用于检测的分子标志物指标包括CEA、CA125、E-钙粘素、β1整合素、MMPs、VEGF等,但是目前国内外基础研究尚未找到一种公认的早期预测进展期胃癌腹膜转移的分子标志物。因此如何找到有效的胃癌腹膜转移早期预测的分子标志物,对于提高胃癌腹膜转移的预防和治疗,改善患者的预后具有重要现实意义。近年来开展的蛋白质组学技术为揭示肿瘤转移机制带来了新的希望。蛋白质组学(proteomics)及其相关技术是近年来新兴的分子生物学分支,是以基因编码的所有蛋白质组为研究对象,了解蛋白质之间的相互作用与联系,从而揭示蛋白质功能以及基因表达调控机制的一个新的研究领域,其核心技术是以双相凝胶电泳(Two-dimensionalpolyacry-lamidegelelectrophoresis,2-DE)为主的蛋白质分离技术和以质谱(massspec-trometry,MS)、生物信息学(Bioinformatics)为主的蛋白质鉴定技术。目前已经有许多新的差异蛋白质组分析方法用于实践,其中荧光差异凝胶电泳(differencegelelectrophoresis,DIGE)技术由于继承了二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,使得DIGE日益受到关注,成为最受欢迎的定量蛋白质组学研究手段之一。DIGE技术通过对用不同的荧光染料对不同的蛋白样品进行标记,在同一块双向凝胶中可同时分离多种蛋白样品,并且每块胶上均引入了内标,内标可以进一步增加可信度,确保结果能反映出真实的生物学差异,避免了系统误差对实验结果的影响。目前,蛋白质组学技术已在多种肿瘤中用于筛选和鉴定同早期诊断、预后以及化疗敏感性等相关的肿瘤标记物。综上所述,本课题主要关注的是寻找同胃癌腹膜转移相关的蛋白质,并选择其中一个差异蛋白进行进一步的功能验证和机制的初步研究。实验的第一部分使用2D-DIGE分离结合MALDITOF/TOF质谱对胃癌组织和相应腹膜转移组织的差异表达蛋白质进行筛选鉴定,共鉴定出27种蛋白质。其中在胃癌腹膜转移组织中表达上调的有23个蛋白质,表达下调的有4个蛋白质,这为今后研究奠定了基础。然后利用生物信息学分析发现在上述这些差异蛋白中,Myosin-9蛋白可能在肌动蛋白细胞骨架重组、肌动蛋白纤维运动、血管生成、细胞-细胞间黏附以及蛋白转运等生物过程中发挥重要作用,根据以上结果我们推测Myosin-9可能参与了胃癌的侵袭和转移过程。因此第二和第三部分我们对Myosin-9进行了更深入的研究,结果发现抑制Myosin-9的表达后,细胞的迁移和侵袭能力减弱,而粘附能力增加,裸鼠腹腔播散肿瘤结节形成数目也明显减少。然后进一步检测上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相关标志物发现,抑制Myosin-9的表达后,胃癌细胞EMT过程受到抑制。基于以上结果,我们认为Myosin-9能够促进胃癌细胞的侵袭和转移能力,此过程可能是通过促进胃癌细胞EMT而实现的。虽然本实验证实Myosin-9影响了胃癌细胞的侵袭转移能力,但是恶性肿瘤的发生和发展是多种基因和蛋白质相互作用的结果,任何单个基因或蛋白质都很难全面说明肿瘤复杂的生物学行为,且Myosin-9在胃癌中更深层次的机制仍需深入研究。在今后的研究中,我们将对更多前期筛选出的差异蛋白质进行分析,通过研究对比蛋白之间的相互关系来阐明胃癌腹膜转移发生发展的机制。此外,研究对象也将不只限于组织和细胞,胃癌腹膜转移患者的血液、体液均可以进行研究,以期能够找到一种有效的进展期胃癌腹膜转移早期预测的分子标志物,提高临床诊断水平,指导胃癌亚临床转移的合理防治。本课题三部分的具体内容如下:第一章胃癌腹膜转移相关差异蛋白质组的分离、鉴定与生物信息学分析目的:将胃癌组织和相应腹膜转移组织蛋白进行分离,找到差异点并进行鉴定,结合生物信息学技术分析,以寻找潜在的预测指标,并为进一步的功能和机制研究提供理论依据。另外本实验还可验证2D-DIGE技术在胃癌研究中的实用价值。方法:以胃癌组织和相应腹膜转移组织为研究对象,将纯化后的蛋白质应用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)进行蛋白质分离,根据DIGE的差异图谱并结合Decyder分析软件进行差异蛋白点分析,差异倍数上调2倍或下调2倍以上的列为差异蛋白点,利用全自动切胶仪Spotpicker挖取这些差异蛋白胶粒,然后进行样品胶内酶解,使用ABI4800MALDITOF/TOF质谱仪进行分析,通过Mascot软件检索Uniprot数据库鉴定蛋白,并结合Westernblot进行验证。最后利用String蛋白相互作用数据库对蛋白质问的相互作用进行预测和分析。结果:1.根据2D-DIGE的差异图谱并结合Decyder分析软件进行差异蛋白点分析,共找到了32个差异蛋白点,然后通过Mascot软件检索Uniprot数据库鉴定蛋白,去除鉴定结果相同的蛋白及未鉴定出来的蛋白点,共鉴定出27种蛋白质。其中在胃癌腹膜转移组织中表达上调的有23个蛋白质,表达下调的有4个蛋白质。2.通过Uniprot数据库分析提示在上述这些差异蛋白中,Myosin-9蛋白可能在肌动蛋白细胞骨架重组、肌动蛋白纤维运动、血管生成、细胞-细胞间黏附以及蛋白转运等生物过程中发挥重要作用,进一步利用String蛋白相互作用数据库分析发现Myosin-9同ACE,RHOB,RHOA,ACTB,SVIL,CDK5,ACTG1,ROCK2,CALD1和S100A4等蛋白构成相互作用网络。基于以上结果分析,我们选取Myosin-9蛋白进行后续功能研究。3.应用Westernblot和免疫组化方法对胃癌组织和相应腹膜转移组织中Myosin-9蛋白的表达水平进行验证,结果显示Myosin-9蛋白在腹膜转移组织中表达增强,与蛋白质组学结果一致。第二章Myosin-9在胃癌侵袭转移中的功能研究目的:探讨Myosin-9对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。方法:利用qRT-PCR和western-blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平上检测Myosin-9在胃癌细胞株中的表达;合成针对Myosin-9的siRNA,利用慢病毒载体感染细胞株,构建稳定低表达Myosin-9蛋白的细胞系;利用纤维链接蛋白实验检测Myosin-9对胃癌细胞粘附能力的影响,Transwell小室迁移和侵袭实验检测Myosin-9对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;构建裸鼠腹腔播散种植模型,观察Myosin-9对胃癌细胞腹膜转移能力的影响。结果:1.相对于人胎儿胃粘膜细胞株GES-1,Myosin-9在其余3株胃癌细胞株AGS、BGC823和SGC7901中均高表达,其中AGS和BGC-823细胞株都来源于胃癌组织(低分化),SGC7901细胞株来源于淋巴结转移组织(中分化),我们选择AGS和SGC7901进行后续实验。2.通过多次预实验,我们确定了细胞接种密度为50%,MOI值为10,Polybrene为4ug/ml的最佳优化条件,western-blot结果显示慢病毒序列1的干扰效果最佳,按照上述条件我们成功构建了稳定低表达Myosin-9蛋白的细胞系SGC7901-siRNA和AGS-siRNA。3.干扰Myosin-9后,细胞粘附实验结果显示细胞粘附能力增强,细胞迁移和侵袭实验结果显示细胞迁移和侵袭能力减弱,以上各组间差异均有统计学意义,P<0.01。4.干扰Myosin-9后,相对于阴性对照组,干扰组腹腔内肿瘤结节形成数目明显减少,两者间差异有统计学意义,P<0.01。第三章Myosin-9在胃癌侵袭和转移中作用机制的初步研究目的:探讨Myosin-9在胃癌侵袭和转移中的作用机制。方法:稳定沉默Myosin-9表达后,利用western-blot方法检测AGS和SGC7901细胞EMT相关标记物E-cadhern、N-cadhern、vimentin和β-catenin的表达情况。结果:相对于阴性对照组和空白对照组,干扰组中E-cadherin表达上调,而N-cadherin、vimentin和β-catenin均表达下调。总之,本研究利用基于2D-DIGE分离-MALDITOF/TOF质谱鉴定-生物信息学分析的差异蛋白质组学技术平台,成功分离并鉴定出胃癌腹膜转移相关的蛋白质,并对其中的一个差异蛋白Myosin-9进行了功能验证和初步的机制研究。通过研究,我们得出以下结论:1.抑制Myosin-9的表达后,胃癌细胞的迁移和侵袭能力减弱,而粘附能力增强,此外裸鼠腹腔肿瘤播散转移能力下降,提示Myosin-9能够促进胃癌的侵袭和转移。2.Myosin-9促进胃癌的侵袭和转移可能是通过促进胃癌细胞EMT过程而发挥作用的,确切的机制仍需进一步研究。本研究的创新处在于:1.建立了胃癌腹膜转移组织差异蛋白图谱;2.证实了胃癌腹膜转移相关蛋白Myosin-9能够促进胃癌的侵袭和转移,并发现Myosin-9表达下调能抑制胃癌细胞EMT过程。
【作者】张磊;
【导师】李国新;
【作者基本信息】南方医科大学,外科学,2014,博士
【关键词】蛋白质组;双向凝胶电泳;质谱;胃癌腹膜转移;Myosin-9;EMT;

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