丘脑腹内侧核高频电刺激改善帕金森病模型大鼠运动障碍表现的研究

【摘要】帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一种中老年常见的进行性神经系统变性疾病,临床上以震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为主要特征。病理特征不仅包括引起核心的运动障碍症状的黑质-纹状体多巴胺能系统变性,而且包括中枢、外周和自主神经系统的多靶点侵犯,并伴有广泛的路易小体和路易轴突的形成。目前该病的临床治疗主要依靠多巴胺替代治疗和外科手术。深部脑刺激(deepbrainstimulation,DBS)是借助立体定向手术,将刺激电极植入病人脑深部特定神经核团,通过刺激发生器产生电脉冲,对核团进行慢性电刺激从而达到消除或改善病人症状的一种治疗方法。目前,该治疗方法已被广泛用于治疗多种功能性神经疾病。其中,丘脑底核高频深部脑刺激(high-frequencydeepbrainstimulationofthesubthalamicnucleus,STN-HFS)已成为晚期帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)外科治疗的首选方法,可显著改善帕金森病病人的震颤、运动徐缓和肌强直三大症状。目前,DBS治疗帕金森病的常用靶点除了底丘脑核和苍白球内侧部外,近年来,又有数个新的核团被发现通过深部脑刺激能够改善帕金森病病人的运动障碍症状,包括：脚桥核、未定带尾部、丘脑中央中核-束旁核复合体和黑质网状部等。研究者们正在积极寻找新的有效靶点,以期能够更好的改善帕金森病运动症状,探讨DBS的治疗机制。丘脑腹内侧核(theventromedialthalamicnucleus,VM)是大鼠运动丘脑的一个重要核团,接受基底神经核输出核团黑质网状部(thesubstantianigraparsreticulata,SNr)和苍白球内侧部(theinternalsegmentoftheglobuspallidus,Gpi)的大量神经纤维投射,并向大脑皮层广泛区域发出神经纤维投射,参与皮层-基底神经核-丘脑-皮层运动环路的组成。以灵长类PD模型和PD患者为研究对象的研究发现接受基底神经核纤维投射的运动丘脑核团电活动发生显著改变。解剖学和电生理研究结果提示丘脑VM核在帕金森病的病理生理机制中可能起到重要作用,也可能是能够有效治疗PD的潜在靶点之一。6—羟基多巴胺偏侧PD大鼠模型是帕金森病研究中较常用的一种动物模型,它可以模拟出PD的主要运动障碍症状,例如：运动不能、运动迟缓、姿势障碍及震颤等。而且这些症状能被多种行为学任务检测和评价。自发跑轮任务是一种常用的行为学检测方法,多个研究采用该任务检测了啮齿类动物的活动水平和这种活动的昼夜节律性。最近,Leng等采用自发跑轮任务检测了帕金森病1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)小鼠模型的运动行为障碍。通过阻断新生多巴胺的合成他们发现MPTP小鼠的自发跑轮活动下降,提示自发跑轮任务可作为一种评价啮齿类动物PD模型运动障碍的工具。本课题应用立体定向技术将6—羟基多巴胺注射入一侧内侧前脑束(medialforebrainbundle,MFB)制作6一羟基多巴胺偏侧帕金森病大鼠模型,检测大鼠自发跑轮行为,探讨该模型的自发跑轮行为；采用肢体不对称测试和自发跑轮行为测试,探讨底丘脑核和丘脑腹内侧核深部脑刺激对该模型运动障碍表现的治疗作用；并采用清醒动物神经元单位放电多通道同步记录技术记录该模型丘脑腹内侧核的神经元放电活动,探讨丘脑腹内侧核在帕金森病病理生理改变中的作用。通过上述研究以期进一步阐明帕金森病运动障碍表现的脑机制,发现深部脑刺激治疗帕金森病新的有效靶点。本论文包括以下四章：第一章6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠自发跑轮行为损害的研究目的：探讨6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠的自发跑轮行为。方法：将25只SD大鼠随机分为实验组17只和对照组8只。实验组大鼠右侧内侧前脑束内注射10μg6-OHDA,对照组注射相同体积的生理盐水。造模前和造模后两组大鼠均进行自发跑轮行为测试,分析以下跑轮行为指标：跑动次数、跑动距离、多次跑动中的平均峰速度和每次跑动中的从跑动开始到峰速度的平均时间。黑质酪氨酸羟化酶免疫组化染色检测黑质多巴胺能神经元毁损程度。跑轮行为指标的比较采用重复测量方差分析,多重比较采用独立样本t检验。SNc内TH免疫阳性神经元残存率的比较采用独立样本t检验。结果：从17只大鼠中获得了10只成功的大鼠帕金森病模型。对照组和成功模型组SNc内神经元残存率分别为99.21±2.89%和8.72±1.56%。成功帕金森病大鼠模型毁损侧黑质致密部内酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞显著丧失。在自发跑轮行为测试中,跑动次数(F=4.612,P=0.002)和跑动距离(F=6.700,P=0.000)存在显著的造模前后与组别间的交互作用。与对照组相比,成功模型大鼠的跑动次数和跑动距离比显著减少(P<0.05)。每次跑动中的平均峰速度(F=8.477,P=0.006)和每次跑动中的从跑动开始到峰速度的平均时间(F=14.472,P=0.000)也存在显著的造模前后与组别间的交互作用。与对照组大鼠比较,成功PD模型大鼠的平均峰速度显著下降(P<0.05),从跑动开始到峰速度的平均时间显著增大(P<0.05)。这些指标的改变在造模后第39天到第42天也仍然能被观察到。结论：6—羟基多巴胺偏侧帕金森病大鼠模型的自发跑轮行为受损,自发跑轮行为测试方法可作为一种检测和量化该模型运动功能障碍的一种有用工具。第二章底丘脑核深部脑刺激改善帕金森病模型大鼠自发跑轮行为的研究目的：探讨底丘脑核深部脑刺激能否改善6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠自发跑轮行为。方法：将35只SD大鼠随机分为实验组24只和对照组11只。利用立体定向的方法将刺激电极埋入右侧底丘脑核,用于注射6—羟基多巴胺的套管埋入右侧内侧前脑束。实验组大鼠右侧内侧前脑束内注射12μg6-OHDA,对照组注射相同体积的生理盐水。采用前肢使用不对称测试和自发跑轮行为测试检测大鼠运动障碍表现。高频电刺激的刺激参数：130Hz,60μs脉宽,电流强度50-175μA。黑质酪氨酸羟化酶免疫组化染色检测黑质多巴胺能神经元毁损程度。苏木素-伊红染色确定刺激电极尖端位置。行为学数据的比较采用重复测量方差分析,多重比较采用LSD方法。SNc内TH免疫阳性神经元残存率的比较采用独立样本t检验。结果：从24只大鼠中获得了17只成功的PD大鼠模型。对照组和成功模型组SNc内神经元残存率分别为102.72±3.27%和9.18±1.66%。成功帕金森病大鼠模型毁损侧黑质致密部内酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞显著丧失。电极尖端位于STN内的成功模型大鼠的不对称指数具有时间上的主效应(F=53.542,P=0.000)。毁损前、毁损后和毁损后给予DBS时的不对称指数分别为0.482±0.023、0.849±0.026和0.556±0.035。与毁损前相比,毁损后的不对称指数显著增大(P=0.000),表明成功模型大鼠偏好使用毁损同侧前肢。给予STN-DBS后,不对称指数显著下降,与毁损后未给予STN-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.038)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.07)；表明STN-DBS改善了患肢的运动功能,从而消除了模型大鼠对健肢的使用偏好。电极尖端位于STN内的成功模型大鼠的跑动次数具有时间上的主效应(F=4.522,P=0.028)。毁损前、毁损后和毁损后给予DBS时的跑动次数分别为33.444±5.842、18.111±3.826和30.222±4.923。与毁损前相比,毁损后的跑动次数显著减少(P=0.011)。给予STN-DBS后,跑动次数显著增加,与毁损后未给予STN-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.032)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.636)；表明STN-DBS改善了PD模型大鼠运动减少的症状。电极尖端位于STN内的成功模型大鼠的跑动距离具有时间上的主效应(F=6.382,P=0.009)。毁损前、毁损后和毁损后给予DBS时的跑动距离分别为36.544±5.732米、18.344±4.313米和30.276±5.616米。与毁损前相比,毁损后的跑动距离显著减少(P=0.006)。给予STN-DBS后,跑动距离显著增加,与毁损后未给予STN-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.03)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.326)。电极尖端位于STN内的成功模型大鼠的平均峰速度具有时间上的主效应(F=7.973,P=0.004)。毁损前、毁损后和毁损后给予DBS时的平均峰速度分别为36.140±1.872米/分、26.747±2.095米/分和33.432±2.368米/分。与毁损前相比,毁损后的平均峰速度显著减小(P=0.001)。给予STN-DBS后,平均峰速度显著增加,与毁损后未给予STN-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.035)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.334)。电极尖端位于STN内的成功模型大鼠的从跑动开始到峰速度的平均时间具有时间上的主效应(F=31.053,P=0.000)。毁损前、毁损后和毁损后给予DBS时的从跑动开始到峰速度的平均时间分别为1.464±0.125秒、2.629±0.131秒和1.604±0.142秒。与毁损前相比,毁损后的从跑动开始到峰速度的平均时间显著增大(P=0.000)。给予STN-DBS后,从跑动开始到峰速度的平均时间显著减小,与毁损后未给予STN-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.001)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.304)。结论：底丘脑核深部脑刺激能够改善6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠的前肢使用不对称行为和自发跑轮行为,6—羟基多巴胺偏侧帕金森病大鼠模型是研究深部脑刺激的良好模型,自发跑轮行为测试在一定程度上可用于筛选抗帕金森病药物或其他治疗方法。第三章6-羟基多巴胺偏侧帕金森病大鼠模型丘脑腹内侧核放电活动改变的研究目的：探讨6-羟基多巴胺偏侧PD大鼠模型丘脑腹内侧核神经元放电活动。方法：实验使用12只SD大鼠。利用立体定向的方法将记录电极埋入两侧丘脑腹内侧核,用于注射6—羟基多巴胺的套管埋入右侧内侧前脑束。右侧内侧前脑束内注射12μg6-OHDA建立6-羟基多巴胺偏侧帕金森病大鼠模型。用清醒动物神经元单位放电多通道同步记录技术记录造模前和造模后两侧丘脑腹内侧核神经元放电活动。黑质酪氨酸羟化酶免疫组化染色检测黑质多巴胺能神经元毁损程度。尼氏染色确定电极尖端位置。平均放电频率比较采用重复测量方差分析。VM放电模式数据毁损前后比较采用配对卡方检验。VM放电模式数据左右侧比较采用成组卡方检验。结果：从12只大鼠中获得了9只成功的PD大鼠模型。在9只成功模型大鼠的左侧VM记录到46个神经元,右侧VM记录到54个神经元。成功帕金森病大鼠模型毁损侧黑质致密部内酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞显著丧失。毁损后左右侧VM平均放电频率分别为15.5287±0.57269Hz和5.6981±0.2791Hz,相比较,差异有统计学意义(t=15.431,P=0.000)。与毁损前相比较,毁损侧VM毁损后平均放电频率显著降低,差异有统计学意义(F=306.701,P=0.000)。与毁损前相比,毁损后毁损侧VM内爆发放电神经元比例显著升高,差异有统计学意义(P=0.001)。毁损后,与健侧VM比,毁损侧VM内爆发放电神经元比例显著升高,差异有统计学意义(χ2=8.355,P=0.004)。结论：6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠丘脑VM核平均放电频率显著降低,而且爆发放电神经元比例升高,丘脑VM核可能在帕金森病病理生理改变中起到重要作用。第四章丘脑腹内侧核高频电刺激改善帕金森病模型大鼠自发跑轮行为的研究目的：探讨丘脑腹内侧核高频电刺激能否改善6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠运动障碍表现。方法：将33只SD大鼠随机分为实验组22只和对照组11只。利用立体定向的方法将刺激电极埋入右侧丘脑腹内侧核,用于注射6—羟基多巴胺的套管埋入右侧内侧前脑束。实验组大鼠右侧内侧前脑束内注射12μg6-OHDA,对照组注射相同体积的生理盐水。采用前肢使用不对称测试和自发跑轮行为测试检测大鼠运动障碍表现。给予丘脑腹内侧核高频(130Hz)和低频(25Hz)电刺激,刺激参数：60μs脉宽,电流强度50-175μA。黑质酪氨酸羟化酶免疫组化染色检测黑质多巴胺能神经元毁损程度。尼氏染色确定刺激电极尖端位置。行为学数据的比较采用重复测量方差分析,多重比较采用LSD方法。SNc内TH免疫阳性神经元残存率的比较采用独立样本t检验。结果：从22只大鼠中获得了15只成功的PD大鼠模型。对照组和成功模型组SNc内神经元残存率分别为98.33±2.86%和9.29±1.78%。成功帕金森病大鼠模型毁损侧黑质致密部内酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞显著丧失。电极尖端位于VM内的成功模型大鼠的不对称指数具有时间上的主效应(F=19.392,P=0.000)。毁损前、毁损后、毁损后给予HFS时和毁损后给予LFS时的不对称指数分别为0.531±0.033、0.854±0.032、0.602±0.052和0.827±0.038。与毁损前相比,毁损后的不对称指数显著增大(P=0.000),表明成功模型大鼠偏好使用毁损同侧前肢。给予高频VM-DBS后,不对称指数显著下降,与毁损后未给予VM-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.009)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.214)；表明高频VM-DBS改善了患肢的运动功能,从而消除了模型大鼠对健肢的使用偏好。给予低频VM-DBS后,不对称指数无明显改变,与毁损后未给予VM-DBS时比较,差异无统计学意义(P=0.4)；而与毁损前相比,差异显著(P=0.036)；表明低频VM-DBS不能改善患肢的运动功能,从而不能消除模型大鼠对健肢的使用偏好。电极尖端位于VM内的成功模型大鼠的跑动次数具有时间上的主效应(F=5.932,P=0.004)。毁损前、毁损后、毁损后给予HFS时和毁损后给予LFS时的跑动次数分别为40.250±6.441、19.500±3.407、31.375±6.179和17.875±3.598。与毁损前相比,毁损后的跑动次数显著减少(P=0.011)。给予高频VM-DBS后,跑动次数显著增加,与毁损后未给予VM-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.017)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.284)；表明VM-DBS改善了PD模型大鼠运动减少的症状。给予低频VM-DBS后,跑动次数无明显改变,与毁损后未给予VM-DBS时比较,差异无统计学意义(P=0.666)；而与毁损前相比,差异显著(P=0.026)；表明低频VM-DBS不能改善PD模型大鼠运动减少的症状。电极尖端位于VM内的成功模型大鼠的平均峰速度具有时间上的主效应(F=13.416,P=0.000)。毁损前、毁损后、毁损后给予HFS时和毁损后给予LFS时的平均峰速度分别为38.383±1.533米／分、24.715±2.586米/分、35.093±2.851米/分和25.828±2.426米/分。与毁损前相比,毁损后的平均峰速度显著减小(P=0.004)。给予高频VM-DBS后,平均峰速度显著增加,与毁损后未给予VM-DBS时比较,差异有统计学意义(P=0.008)；而与毁损前相比,差异不显著(P=0.247);可能表明高频VM-DBS改善了PD模型大鼠患肢的运动不能表现。给予低频VM-DBS后,平均峰速度无明显改变,与毁损后未给予VM-DBS时比较,差异无统计学意义(P=0.64)；而与毁损前相比,差异显著(P=0.002)；可能表明低频VM-DBS不能改善PD模型大鼠患肢的运动不能表现。结论：丘脑腹内侧核高频电刺激能够改善6—羟基多巴胺偏侧帕金森病模型大鼠的运动障碍表现,丘脑腹内侧核可能是帕金森病深部脑刺激治疗的潜在有效靶核团。
【作者】潘琪；
【导师】徐如祥；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科学，2014，博士
【关键词】帕金森病；深部脑刺激；丘脑腹内侧核；大鼠；

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