“幽门螺杆菌—胃黏膜上皮”生物界面黏附行为的研究

【摘要】研究背景和目的：胃黏膜上皮与其周围环境(微生物、食物等)的相互作用-生物界面在促进营养物质消化、吸收和抵抗外界致病因素侵袭等方面发挥重要作用。其中,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)与胃黏膜上皮黏附构成的H.pylori-胃黏膜上皮生物界面(H.pylori-gastricmucosalepitheliumbiointerface,H.pylori-GMEbiointerface)对探究H.pylori感染胃黏膜上皮的机制以及预防和治疗H.pylori感染引起的胃肠道疾病至关重要。据临床病理学研究表明：当H.pylori侵入胃黏膜后,大约21%的H.pylori与胃黏膜上皮细胞直接接触。通过经典的分子生物学手段,我们发现H.pylori通过菌体外膜蛋白(Outermembraneproteins,OMPs)与胃黏膜上皮细胞表面相应的受体特异性结合,从而与胃黏膜上皮形成稳定黏附。例如,BabA和SabA是两种常见的黏附素,它们分别通过特异性地识别Lewisb和唾液酸化的Lewis”受体促进H.pylori的稳定黏附并引起组织炎症反应。CagL蛋白表达阳性的H.pylori通过与胃黏膜上皮细胞表面的integrinβ1特异性结合,从而启动Ⅳ型分泌系统将细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associatedgeneAprotein,CagA)转移到感染的胃黏膜上皮细胞内并引起细胞功能异常。其它黏附素如,HopZ,AlpA/A1pB和OipA也参与黏附过程,并作为免疫靶点用于抗H.pylori疫苗的研制。但是由于H.pylorri-GME生物界面的复杂性,其它表面因素也可能影响H.pylori的黏附行为。通过研究生物界面的作用机制发现,生物界面通过拓扑结构、化学成分与黏弹性图案,使其与蛋白质在纳米尺度、细胞和组织在微米尺度上匹配,从而形成特定的生物医学功能。生物小分子(化学成分)是构成人体内各组织结构的最小单位,它决定不同组织的性质。并且依次通过纳米水平、微米水平的自组装,从而形成特殊的微-纳米复合结构(拓扑结构),后者又表现出独特的力学性质(黏弹性图案),最终影响各组织器官的宏观功能。这就是微尺度构建-功能-力学耦合机制。因此,除了关键分子蛋白的相互作用,H.pylori-GME生物界面的微尺度形貌和力学因素也影响H.pylori的黏附行为。但由于研究方法和技术手段的限制,目前此方面的研究还很少。本文利用纳米加工技术仿生制备了H.pylori-GME生物界面微尺度形貌。并通过细菌黏附实验在体外研究H.pylori-GME生物界面微尺度形貌对细菌黏附行为的影响。另一方面,借助刚度可控的高分子材料仿生模拟不同胃黏膜上皮细胞外基质力学环境,并利用力学表征手段以及分子生物学方法探究其对H.pylori-GME生物界面黏附行为的作用。从而补充H.pylori与胃黏膜上皮的黏附机制,为临床诊断和治疗H.pylori感染引起的胃肠道疾病提供新思路。方法：首先,我们参考H.pylori感染相关的临床病理研究确定不同病理阶段胃黏膜上皮微尺度形貌变化的参数。再利用反应离子刻蚀(Reactiveionetching,RIE)技术,在体外制备H.pylori-GME生物界面特征形貌的仿生结构。根据不同种属细菌(幽门螺杆菌、大肠杆菌和金色葡萄球菌)黏附实验结果并结合定量的形貌学分析阐述H.pylori-GME生物界面形貌影响细菌黏附的规律。然后,我们利用聚丙烯酰胺(Polyacrylamide,PAAm)水凝胶体系,模拟胃黏膜上皮细胞外基质的不同力学环境。从而研究刚度对H.pylori与胃黏膜上皮细胞(GES-1)黏附的影响。并利用原子力显微术(Atomicforcemicroscopy,AFM)与分子生物学手段对可能的机制进行初步探讨。最后,基于环境扫描电子显微镜(Environmentalscanningelectronicmicroscope,ESEM)在生物样本成像方面的优势,对利用不同形貌的金纳米颗粒定位A549细胞表面蛋白的方法进行探索,为进一步研究力学因素影响H.pylori与胃黏膜上皮细胞黏附的分子机制提供新方法。本文数据均利用SPSS13.0软件进行分析,其中连续型变量以均数±标准差(x±s)来表示,非连续型变量采用中位数和四分位数(M(Q1；Q2))。并且利用相应的参数检验方法对连续性变量的进行统计学分析；利用相应的非参数方法对非连续型变量进行统计学分析。结果：1.H.pylori-GME生物界面微尺度形貌仿生结构对细菌黏附的影响1.1H.pylori-GME生物界面微尺度形貌的仿生结构参数和物理性质根据文献报道,正常胃黏膜上皮细胞表面形貌是由一定间距、粗细均匀的微绒毛阵列构成。其中微绒毛直径大约为200nm；高度大约为500nm。绒毛间距大约为200nm。并且H.pylori感染导致其变短和消失,以及肠上皮化生的出现。由此可见,H.pylori-GME生物界面微尺度形貌就是高度和间距逐渐变化的微绒毛阵列。通过RIE对聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)的精细加工,我们在体外成功地仿生了H.pylori-GME生物界面特殊形貌,即柱高度(200nm、700nm和1200nm)和间距(50nm、200nm和400nm)逐渐变化的直径约为250nm的纳米柱阵列。通过AFM和接触角测量仪表征,我们获得了PET纳米柱结构以及PET平面结构的表面物理性质参数,且以均数±标准差(x±s)表示。与PET平面结构相比(Ra、Rq和WCA的95%可信区间分别为1.8-3.6；2.3-4.4；100.3-117.4),PET纳米柱阵列相对粗糙且亲水(Ra=17.4～257.9；Rq=21.1～333.4；WCA=100.3～117.4)。通过析因资料的方差分析,结果表明PET纳米柱阵列的高度和柱间距影响了结构表面的粗糙度和亲疏水性质。一方面,柱高度对PET纳米柱阵列粗糙度的影响有显著的统计学差异(Ra值F=143.480,P<0.001；Rq值F=182.213,P<0.001)。并且结合多组间比较检验(Bonferroni法或DunnettT3法)发现,在柱间距50nm的纳米柱阵列中,随着高度增加粗糙度有增加的趋势,但无显著统计学差异(Ra值P=0.209；Rq值P=0.393)；柱间距为200nm和400nm的纳米柱阵列中,随着高度增加粗糙度逐渐增加,并且有显著统计学差异(Ra值P=0.014,Rq值P=0.063;Ra值P<0.001,Rq值P<0.001)。另外,柱间距对PET纳米柱阵列粗糙度的影响有显著的统计学差异(Ra值F=887.891,P<0.001；Rq值F=928.372,P<0.001)。随着柱间距增加,纳米柱阵列的粗糙度也逐渐增加(均P<0.050)。另一方面,柱间距对PET纳米柱阵列WCA的影响有显著差异(F=45.894,P<0.001)。在高度为200nm的纳米柱阵列中,不同柱间距的纳米柱阵列的WCA有无显著统计学差异(P=0.548)。在高度为700nm和1000nm的纳米柱阵列中,随间距增加WCA也逐渐增加,且具有显著统计学差异(P=0.004；P<0.001)。另外,高度对PET纳米柱阵列WCA的影响有显著的统计学差异(F=139.532,P<0.001)。随着高度增加,纳米柱阵列的WCA也逐渐增加(均P<0.001)。1.2H.pylori-GME生物界面微尺度形貌的仿生结构细菌黏附的影响通过细菌黏附实验发现,柱高度和间距规律变化的仿生微绒毛结构影响了细菌黏附的数量。结果以均数±标准差(x±s)表示。利用析因资料的方差分析发现,无论细菌的种属和形貌,柱高度对细菌黏附的影响无显著统计学差异(H.pylori43504F=0.151,P=0.860;S.aureus6538F=1.508P=0.350;E.coliBL21F=0.019P=0.982)。而纳米柱间距对细菌黏附数量的影响都有相似的规律(H.pylori43504F=480.631,P<0.001;S.aureus6538F=879.873,P<0.001;E.coliBL21F=250.481,P<0.001).去除柱高度因素,再次研究三种细菌在不同PET机构上的黏附规律。通过完全随机设计资料的方差分析检测表明：三种细菌4组间方差不齐(均P≤0.001),并且不同PET结构对三种细菌的黏附都具有显著统计学差异(H.pylori43504F=498.090,P<0.001;S.aureus6538F=609.183,P<0.001;E.coliBL21F=178.220,P<0.001)。利用Dunnett’sT3方法进一步进行多重比较发现,与PET平面结构(control)相比,柱间距为50nm的纳米柱阵列促进了H.pylori43504和S.aureus6538的黏附(104.6±12.7vs69.7±9.3,P<0.001;190.4±21.8vs134.0±11.7,P<0.001)但并未影响E.coliBL21的黏附(46.8±12.5vs51.7±14.9,P=0.830)；与柱间距50nm的纳米柱阵列相比,增大的柱间距(200nm和400nm)抑制了H.pylori43504和E.coliBl21的黏附(H.pylori4350458.4±7.6和45.3±6.6vs104.6±12.7,均P<0.001;S.aureus653854.9±12.5和86.9±12.5vs190.4±21.8,均P<0.001；E.coliBL2126.9±7.1和5.5±3.7vs46.8±12.5,均P<0.001)。但与200nm柱间距相比,400nm柱间距反而促进了S.aureus6538的黏附(54.9±12.5vs86.9±12.5,P<0.001)。此外,增大的柱间距对细菌表面附属器和细胞外多聚物分泌的也有一定影响。利用CellTool软件对不同间距的PET阵列和平面结构上的黏附细菌进行形貌分析,我们发现纳米柱阵列上细菌的形态变异的参数,结果以中位数和四分位数表示。通过采用Kruskal-WallisH非参数检测法分析发现,纳米柱阵列的间距影响有显著差异(E.coliBL21X2=26.428,P<0.001;S.aureus6538X2=73.002,P<0.001;H.pylori43504X2=20.257,P<0.001)。并且形态变化与细菌种属直接关系。进一步比较采用Wilcoxon秩和检验进行任意两组间比较得知,Eeoli的主要形貌变异模型只有一种,即中心轴长度的变异。与平面对照组相比,纳米柱阵列上的E.coli长度相对较短(P<0.001),且随着柱间距增大有减少的趋势。S.aureus主要形貌变异模型有三种,即直径变异和两种次要的局部边缘曲率变异。由于直径变异占主要部分,且其他两种变异也可由直径变异部分表述,所以选择细菌的平均直径为评估其主要形貌变异的参数。与平面对照组相比,纳米柱阵列上的S.aureus平均直径相对较大(均P<0.001),且随着柱间距增大有减少的趋势。H.pylori的主要变异模型有四种,即中心轴长度变异和三种边缘曲率变异。因此,中心轴长度和边缘曲率都可应作为形貌变异参数。为了方便表述,用边缘曲率与中心轴长度的比值(RCL)来表示H.pylori的主要形貌变异。与其它结构相比,H.pylori43504在400nm柱间距的纳米柱阵列上形态更加弯曲(均P≤0.002),且随着柱间距增大有减少的趋势。2.H.pylori-GME生物界面刚度对H.pylori的影响2.1不同刚度PAAm水凝胶基底对H.pylori与GES-1细胞黏附的影响通过ESEM电镜表征,我们可以定量不同刚度PAAm水凝胶基底上GES-1细胞黏附H.pylori的情况。结果以均数±标准差(x±s)表示。通过与细胞表面微绒毛直接接触而利于其黏附,并且倾向黏附在细胞质区边缘处。根据经完全随机设计资料的方差分析检验结果表明,不同刚度的PAAm水凝胶基底上单个GES-1细胞表面黏附的H.pylori数量有显著差异(F=55.880,P<0.001)。采用Bonferroni法进行任意两组间比较发现：与0.7kPaPAAm水凝胶基底相比,增大的基底刚度促进了H.pylori与GES-1细胞的黏附(均P<0.001)。其中,在3.8kPaPAAm水凝胶基底上,单个GES-1细胞表面黏附的H.pylori数量最多(17.6±4.4,均P≤0.005)。并且8.4kPa和21.5kPaPAAm水凝胶基底上的单个GES-1细胞表面黏附的H.pylori数量无显著差异(14.2±3.6vs14.3±4.0,P=1.000)。但H.pylori在Ⅰ型胶原蛋白修饰PAAm水凝胶基底黏附能力差,数量少。且不同刚度基底上H.pylori黏附数量无明显差异(X2=1.738,P=0.628)。2.2不同刚度PAAm水凝胶基底对GES-1细胞形态和物理性质的影响随着基底刚度的增加,GES-1细胞形态发生了改变。在0.7kPa基底上,细胞很难铺展,呈类球形,细胞成团聚集。并且细胞表面有较多短而钝的微绒毛。当基底刚度达到8.4kPa时,细胞已完全铺展,细胞表面有较少长而细的微绒毛,并且细胞边缘有较多丝状伪足。利用AFM我们得到GES-1细胞表面物理参数,结果以中位数和四分位数表示。通过Kruskal-WallisH非参数检测法检验发现,不同刚度PAAm水凝胶基底上的GES-1细胞微区刚度有显著差异(细胞质边缘区X2=47.025,P<0.001；细胞核区X2=14.075,P=0.003)。进一步Wilcoxon秩和检验进行任意两组间比较发现：随着基底刚度增加,细胞微区刚度也逐渐增加。但是在8.4kPa和21.5kPa刚度基底上,GES-1细胞的细胞质边缘区刚度无差别(P=0.193),但核区刚度有显著差别(P=0.003)。并且在各组刚度基底上,细胞质边缘区的刚度都要大于核区(t=3.762,P<0.001；t=2.680,P=0.007；t=4.008,P<0.001:,=5.199,P<0.001).另外,不同刚度PAAm水凝胶基底上的GES-1细胞微区与AFM探针的黏附功有显著差异(细胞质边缘区X2=52.163,P<0.001；细胞核区X2=46.775,P<0.001)。并且通过Wilcoxon符号秩检验发现：除在3.8kPa刚度PAAm水凝胶基底上细胞微区间黏附功无显著差异(t=0.355,P=0.723)外,细胞质边缘区的黏附功都要大于核区(t=2.584,P=0.010；t=3.895,P<0.001;t=5.470,P<0.001)。2.3不同刚度PAAm水凝胶基底对GES-1细胞integrinβ1蛋白表达的影响通过westernbolt和免疫荧光显微术半定量的检测GES-1细胞integrinβ1蛋白表达,结果以均数±标准差(x±s)表示。经完全随机设计资料的方差分析检验结果表明,不同刚度PAAm水凝胶上GES-1细胞integrinβ1蛋白的表达有明显差异(F=250.372,P<0.001)。由于4组PAAm水凝胶基底间方差不齐(P=0.038),因此采用DunnettT3法进行多组间比较,结果表明与0.7kPa刚度PAAm水凝胶上GSE-1细胞integrinβ1蛋白表达水平(0.7±0.0)相比,其它刚度PAAm水凝胶上GSE-1细胞integrinβ1蛋白表达增加(均P<0.050)。并且3.8kPa刚度PAAm水凝胶上GSE-1细胞integrinβ1蛋白表达水平最高(2.3±0.2,均P<0.050),但与8.4kPa刚度PAAm水凝胶上GSE-1细胞integrinβ1蛋白表达无统计学差异(P=0.217)。3.生物界面表面多蛋白分子标记技术探索通过修饰特异性抗体的不同形貌的金纳米颗粒(金纳米棒和金八面体)对A549细胞表面insulinreceptor和caveolin-1蛋白标记发现：相比于非特异性吸附作用,通过特异性结合可以识别细胞膜表面的insulinreceptor和caveolin-1蛋白,并且发现的两者分布具有一定重合。结论：1.H.pylori-GME生物界面特征形貌是由高度和间距逐渐变化的微绒毛阵列构成。随着微绒毛间距和高度的增加,界面表面粗糙度增加,并且趋于疏水。增大的微绒毛间距抑制了细菌的黏附,并且对特殊形态的细菌进行筛选。2.H.pylori-GME生物界面的力学性质和关键蛋白的表达受胃黏膜上皮细胞外基质刚度的影响。胃黏膜上皮细胞外基质刚度通过增加胃黏膜上皮细胞表面integrinβ1蛋白的表达,而不是直接通过增加的细胞表面刚度促进H.pylori与胃黏膜上皮细胞的黏附。3.基于不同形貌金纳米颗粒的生物界面表面蛋白分子标记技术可作为研究生物界面多蛋白相互作用的表征方法。
【作者】金麟；
【导师】郭文；张亚历；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】幽门螺杆菌；胃黏膜上皮；黏附；生物界面；形貌；刚度；

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