川西云杉早期体细胞胚胎发生机理研究

【摘要】川西云杉作为常绿针叶树，广泛分布在我们西南和西藏东部。由于其生长较快且材质优良常被作为造林树种。但是目前川西云杉苗主要是通过实生繁殖，但其实生苗前期生长缓慢，结实比较晚，而且，实生种子园由建园到生产可用种子需时极长，致使川西云杉种子供不应求，远远不能满足造林需求。采用体细胞胚胎发生技术繁殖川西云杉优良无性系，可解决其生产上种苗供应不足的问题奠定基础。体细胞胚胎发生的能力受基因型的影响且没有完全被研究清楚。本研究从转录组学和蛋白质组学两个水平来研究川西云杉一个胚胎发生能力良好的细胞系在添加不同浓度6-BAP的培养基上长期继代后的基因和蛋白质变化。为了研究川西云杉早期胚胎发生的分子机制，本文采用最新的RNA-Seq技术对不同基因型的胚性与非胚性愈伤组织之间的差别进行了研究，然后结合RNA-Seq，iTRAQ以及GS-MS技术对不同浓度6-BAP对胚胎发生能力的影响进行了深入的探讨。最后还对激素，抗氧化酶和多胺进行了测定以进一步阐明体细胞胚胎发生早期的发生机理。主要结果如下：以川西云杉8个基因型不同发育阶段的合子胚为外植体，探索不同发育阶段，基本培养基以及不同激素等添加剂对川西云杉胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚的分化、萌发的影响。Stage2为最适于胚性愈伤组织诱导和体胚诱导的发育阶段；1/2LM培养基+10μM2,4-D+5μM6-BAP+3.8μMABA或20μMAgNO3是诱导胚性愈伤组织最适的培养基，愈伤组织诱导率最高为40%；1/2LM培养基+61μMABA+0.4%活性炭是体细胞胚诱导和分化的最佳培养基，平均每100mg胚性愈伤组织可以形成124个体细胞胚；最适体细胞胚萌发培养基为1/4LM+0.125%活性炭+50μM抗坏血酸，最高萌发率为24.83%。该研究发现脱落酸，硝酸银均可将川西云杉胚性愈伤组织的诱导率提高10%以上。转录组测序一共获得54978834条reads，经过滤比对后共得到68070条unigene，其中18897条（27.8%）unigene在GO中找到分类，15439条（22.7%）unigene可以比对到121个KEGG的通路，这些基因所属类别占所有功能类别中的绝大多数。数字表达谱升级版测序的分析结果表明胚性与非胚性愈伤组织间共有3280个差异表达的基因，其中1371个上调的，1909个下调的（P<0.05）。影响胚胎发生能力的基因参与很多通路，包括植物-病毒交互作用，淀粉和蔗糖代谢，植物激素信号转导。此外SERK和阿拉伯半乳糖蛋白可以作为早期胚胎发生中胚性愈伤组织的分子标记。RNA-seq和iTRAQ去低质量之后分别获得51375个unigene和2617个蛋白，其中有2770个转录因子可以比对到蛋白质上。对差异表达的unigene和蛋白进行GO分析表明unigene和蛋白大多参与细胞和结合作用，它们的代谢途径富集在核糖体和谷胱甘肽代谢。核糖体蛋白，谷胱甘肽S-转移酶蛋白，germin-like蛋白和不依靠钙调素蛋白酶在胚胎发生能力强的愈伤组织（3.6μM）中的表达量均高于低胚胎发生能力中的。qRT-PCR验证表明与胚胎发生能力相关的基因在转录水平上显著上调。上述四种蛋白及其转录因子是早期胚胎发生能力的候选分子标记。采用GS-MS技术研究三种浓度6-BAP处理下愈伤组织的代谢物变化。一共获得了309个代谢物，其中（12339.8%）个代谢物可以比对到KEGG中。3个处理间有35个代谢物的含量发生了极显著的变化，其中2.5μM和5μM两个6-BAP处理间有差异代谢物32个。共有17个代谢物质只存在于1组比较中。S-plot和Loadingplot表明在较高胚胎发生能力的愈伤组织中含量增加的代谢物大多为氨基酸，而大多碳水化合物（尤其是各种糖类）的含量是降低的。这些结果表明6-BAP可能通过氮代谢影响愈伤组织的胚性发生能力，如调控天冬氨酸盐，异亮氨酸和亮氨酸。此外，胚胎发生能力最强的愈伤组织中（3.6μM）色氨酸的含量最低，其可以通过很多途径生成愈伤组织诱导和增殖的必要内源激素IAA，由此我们推测6-BAP可能通过调控色氨酸的含量间接的影响愈伤组织中IAA的含量从而影响其胚胎发生能力。天门冬酰胺和色氨酸，丝氨酸等可作为胚胎发生能力的标记代谢物。三个基因型的胚性愈伤组织中四种激素的含量均较非胚性愈伤组织中的含量低。而胚性愈伤组织的SOD活性以及多胺的含量则均显著高于非胚性愈伤组织。3.6μM6-BAP处理的愈伤组织中IAA的含量和SOD的活性最高，ZR的含量和POD的活性最低，分化后IAA和ZR的含量均要低于其它两个处理，而GA3和ABA的含量则均高于其它两个处理。3.6μM6-BAP处理的愈伤组织中多胺的含量要高于其它两个处理，特别是分化综上所述，川西云杉早期体细胞胚胎发生是涉及复杂的生理机制和分子水平上的基因、蛋白以及代谢物的参与，是它们相互作用的结果。对川西云杉早期体细胞胚胎发生调控机理的研究，为得到高胚胎发生能力的愈伤组织奠定了基础，并为体细胞胚胎发生技术在针叶树上的应用提供了重要依据。
【作者】李青粉；
【导师】王军辉；
【作者基本信息】中国林业科学研究院，林木遗传育种，2014，博士
【关键词】川西云杉；体细胞胚胎发生；RNA-seq；iTRAQ；代谢组学；

【参考文献】
[1]周豪.IP网和向量网的性能建模与仿真研究[D].北京交通大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[2]李昕.论亦舒小说的都市书写[D].宁波大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[3]张文兵.基于碎片化学习的邮件订阅系统设计与实现[D].华中师范大学,现代教育技术,2014,硕士.
[4]阚英.基督教与西方宪政的发展[D].山东大学,法律,2013,硕士.
[5]曹卫斌.乡村旅游游客忠诚的影响因素研究[D].浙江大学,2013.
[6]郝建丽.齿轮坯闭式模锻CAPP系统的研制及其关键技术[D].太原理工大学,材料加工工程,2004,硕士.
[7]张丽亚,薛鹏,张娟,张力.硅基负极材料电化学性能优化的系统研究[A].中国硅酸盐学会固态离子学分会.第17届全国固态离子学学术会议暨新型能源材料与技术国际研讨会论文集[C].中国硅酸盐学会固态离子学分会:,2014:1.
[8]高利增,阎锡蕴.纳米酶的发现与应用[J].生物化学与生物物理进展,2013,10:892-902.
[9]李忠源.论我国监狱模式的建构[D].华南理工大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[10]商报记者孙黎明　任忠君实习生龙搏腾宇.东城再造西城再战九龙坡建八大功能板块[N].重庆商报,2013-10-14A04.
[11]黄宗圆.现行小学《语文》儿童文学选文初探[D].福建师范大学,文学阅读与文学教育,2013,硕士.
[12]刘洋.TiO_2/GO纳米材料的制备及其超滤膜的性能研究[D].哈尔滨工业大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[13]苗银卓.我国房屋征收补偿法律制度研究[D].首都经济贸易大学,民商法学,2013,硕士.
[14]NikolaJokanovié.Explaining the Dynamics of European Union’s Arms Embargo on China[D].外交学院,国际关系,2014,硕士.
[15]陈氏映雪（TranThiAnhTuyet）.Weka环境下模糊聚类算法集成研究[D].上海大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[16]李博,杨丹,张小洪,马丽涛.基于LMI技术的两个神经元的时滞混沌神经网络的耦合延迟同步研究(英文)[J].自动化学报,2007,11:1196-1199.
[17]周宁,刘玮,严亚兰.虚拟数据库技术的发展和应用[J].情报科学,2002,02:171-174.
[18]巩菲.商业银行理财产品收益的影响因素分析[D].西南交通大学,金融学,2014,硕士.
[19]徐庭华.右归丸加味颗粒治疗肾阳不足型男性不育症的临床研究[D].北京中医药大学,中医外科学,2013,硕士.
[20]赵颖.利用大石桥菱镁矿制备高纯氧化镁的研究[D].东北大学,应用化学,2011,硕士.
[21]陈曦.敦煌飞天壁画艺术在现代礼服设计中的研究与开发[D].长春工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[22]彭勤.基于EVA的上市公司财务危机预警研究[D].武汉理工大学,会计学,2012,硕士.
[23]彭曙蓉.射频卡和指纹识别技术在数字校园系统中的应用研究[D].湖南大学,控制理论与控制工程,2003,硕士.
[24]王晨曦.奥巴马政府东亚政策评析[D].辽宁大学,国际关系,2012,硕士.
[25]陈岚.企业资源计划在出口信用保险管理中的应用研究[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[26]杨玉刚.大学生领导力结构及影响因素实证研究[D].郑州大学,企业管理,2013,硕士.
[27]毛羽丰.政府债务与央行独立性研究[D].贵州财经大学,金融学,2013,硕士.
[28]李楠.基于特征的领域工程及构件技术应用研究[D].西南交通大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[29]陈慧银.南昌职业学院团员信息管理系统分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[30]邹丽媛.中国大学生英语水平与社会认知能力的关联性研究[D].宁波大学,外国语言文学,2013,硕士.
[31]李鲁华.纳米粒子介导外源基因在植物中的稳定表达[D].吉林农业大学,作物生物技术,2012,硕士.
[32]周洁琼,王立德,王涛,申萍.基于交换式以太网的列车通信网络的交换机排队时延分析[J].北京交通大学学报,2014,02:95-100.
[33]庄铭锴.黄芩素通过下调TGF-β信号通路抑制人胃癌细胞株AGS的迁移侵袭[D].福建医科大学,内科学,2014,硕士.
[34]丁彦波.基于Java的企业信息系统的研究[D].天津大学,机械电子工程,2004,硕士.
[35]董轩汝.房地产企业资本结构与企业价值关系研究[D].西北大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[36]戚炎君.行为经济学视角下企业CIO的管理行为研究[D].苏州大学,情报学,2013,硕士.
[37]夏力亮.鲍曼不动杆菌bla_(NDM-1)基因分子遗传学分析及表达与活性研究[D].吉林大学,预防兽医学,2013,硕士.
[38]陶莎,张玉红.基于数据仓库技术的企业信息化评价系统[J].技术经济与管理研究,2005,06:53-54.
[39]肖骁.基于文档间相似性的Top-k排序学习方法[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2014,硕士.
[40]韩瑞.双层网架支柱球罐支撑结构力学特性分析研究[D].东北大学,化工过程机械,2010,硕士.
[41]张昊.有机硅烷改性介孔二氧化锰制备及吸附除铜机制研究[D].河北科技大学,环境工程,2013,硕士.
[42]郑郁郁.大学校园门户空间环境研究[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2004,硕士.
[43]杨超君,蒯苏苏,孙建荣,符永宏.滑动轴承摩擦因数方程的改进与应用[J].农业机械学报.2004(06)
[44]王兴军,苏昭棠,周治平.硅基光电子学的最新进展[J].中国科学:物理学力学天文学,2015,01:15-45.
[45]赖晓龙.802.11无线局域网的安全技术[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2004,硕士.
[46]岳珂.拥挤交通环境下高速公路重型车车辆折算系数的确定[D].长安大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[47]邹杏梓.利用“学案导学”促进高中生英语自主学习的研究[D].华中师范大学,英语学科教学,2013,硕士.
[48]陈德全.受贿罪若干问题研究[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[49]田希泰.谱分解地表异常补偿[J].石油地球物理勘探,1984,05:423-436.
[50]刘艳.超级电容器用石墨烯/聚合物复合材料的制备及其性能[D].中南大学,2012.