IL-8/CXCL8及其受体拮抗剂G31P对动脉粥样硬化形成的影响及相关分子机制研究

【摘要】背景：动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种与脂质代谢障碍有关的，以大、中动脉内膜脂质沉着、粥样斑块形成、管壁硬化为特征的全身性疾病。动脉粥样硬化是许多心脑血管疾病的重要病理基础，给人类的健康造成了极大地危害。但AS的发病机制至今尚未明确。近年，炎症学说的提出和建立为AS的研究指明了方向。该学说认为“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”，其发生和发展伴随炎症反应。白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）又称趋化因子8（C-X-Cmotifligand8,CXCL8），是趋化因子超家族中的一员，与炎症性疾病密切相关。研究已经证明IL-8/CXCL8等趋化因子及其特异性受体在动脉粥样硬化中起重要作用。除单核巨噬细胞外,血管内皮细胞、血管平滑肌细胞也能产生IL-8/CXCL8，而血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的增殖和迁移，是形成动脉粥样硬化的重要环节之一。关于IL-8/CXCL8对血管平滑肌细胞的趋化作用的分子机制，目前国内外尚未见报道。CXCL8(3-72)-K11R/G31P(简称G31P)为采用基因点突变制备的人IL-8/CXCL8突变体，研究已经证实它具有高亲和力的结合CXCR1/CXCR2，但无生物学活性，与IL-8/CXCL8竞争性结合CXCR1/CXCR2，故被认为是IL-8/CXCL8拮抗剂。相关实验研究发现G31P在肺血管病变、前列腺癌等炎症性疾病中发挥着重要的抗炎作用，使疾病向有利的方向发展。那么，G31P在高脂血症和动脉粥样硬化小鼠模型中是否可以降低炎症反应，是否可以抑制血管平滑肌细胞向血管内膜的增殖和迁移，从而达到延缓和控制高脂血症和动脉粥样硬化的发生发展？IL-8/CXCL8在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞中是否具有一定的趋化作用，G31P是否具有一定的抑制效果呢？这些都是本实验所关注的研究内容。目的：1、通过建立高脂血症小鼠模型，探讨IL-8/CXCL8在高脂血症小鼠体内调节炎症反应（TNF-α、γ-IFN）以及对血管平滑肌细胞增殖和迁移（mef2a、PCNA、MMP-2、MMP-9）的影响，并观察G31P是否可以抑制高脂血症小鼠炎症反应及血管平滑肌细胞的增殖和迁移。2、通过建立动脉粥样硬化小鼠模型，探讨IL-8/CXCL8在动脉粥样硬化小鼠模型中通过CXCR2调节炎症反应（TNF-α、γ-IFN）以及对血管平滑肌细胞增殖和迁移（mef2a、PCNA、MMP-2、MMP-9）的影响，并观察G31P是否可以抑制动脉粥样硬化小鼠炎症反应及抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。3、探讨IL-8/CXCL8对体外培养的血管平滑肌细胞（A7r5）增殖和迁移的影响，并检测G31P是否可抑制IL-8/CXCL8诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4、初步探讨G31P抑制IL-8/CXCL8诱导的血管平滑肌细胞（A7r5）增殖、迁移的信号转导途径。方法：1、体内实验部分：（1）高脂血症动物模型的建立：30只雄性BALB/c小鼠随机分为三组：对照组（control，标准饮食，皮下注射生理盐水），高脂血症模型组（H.F.D，高脂饮食，皮下注射生理盐水）和G31P处理组（G31P，高脂饮食，皮下注射G31P），喂养8个月后，测定血脂等生化指标确定高脂血症模型是否建立成功。（2）动脉粥样硬化动物模型的建立：20只雄性APOE-/-小鼠随机分为二组：动脉粥样硬化模型组（AS，皮下注射生理盐水）和G31P处理组（G31P，皮下注射G31P）。对照组为其野生型C57BL/6J小鼠（control，标准饮食，皮下注射生理盐水）。AS和G31P处理组均予高脂饲料喂养12周，观察主动脉病理学改变确定动脉粥样硬化模型是否建立成功。（3）采用ELISA方法检测动物血清中IL-8/CXCL8的含量。（4）使用生化学方法检测血清中CHO、TG、LDL-C和HDL-C的动态改变。（5）采用RT-PCR和免疫组化方法检测主动脉血管中KC、CXCR2、TNF-α、γ-IFN、MMP-2、MMP-9、PCNA和mef2a等细胞因子的表达。2、体外实验部分：（1）运用RT-PCR检测体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞（A7r5）中IL-8/CXCL8受体的表达；（2）MTT细胞增殖实验研究IL-8/CXCL8诱导血管平滑肌细胞的增殖以及G31P的抑制作用；（3）细胞划痕法和Bordernchamber法测定IL-8/CXCL8诱导血管平滑肌细胞的迁移以及G31P的抑制作用；(4)采用免疫蛋白印迹技术，检测IL-8/CXCL8与MAPK途径中ERK信号转导通路的相关性，以及G31P抑制ERK通路的级联活化。结果：1、第一部分实验：（1）体重：实验结束后，H.F.D组与control组相比体重增长差异显著（p<0.01）。G31P处理组小鼠体重的增长速度要低于H.F.D组（p<0.01）。（2）血脂：每隔2个月于小鼠眼眶取血，收集血清检测血脂变化，H.F.D组小鼠血清中CHO、TG、LDL-C均显著高于control组，而HDL-C低于control组，具有统计学意义（p<0.01），符合高脂血症诊断标准。G31P处理组，血清中CHO、TG、LDL-C含量明显降低，同时HDL-C含量升高（p<0.01），说明G31P具有一定程度的降低血脂的作用。（3）病理学改变：高脂饮食诱导8个月后，光镜下小鼠主动脉血管中未见泡沫细胞及血管平滑肌细增殖和迁移。电镜下，H.F.D组小鼠血管内皮细胞处发现有平滑肌细胞，此迁移至内膜处的平滑肌细胞内可见吞噬的大小不一的脂肪细胞，说明高脂饮食诱导8个月后，已经出现血管平滑肌细胞的迁移，并逐渐向泡沫细胞转化，证明该动物模型已进入动脉粥样硬化病变的早期阶段。（4）KC含量：H.F.D组血清中KC含量显著增加，G31P组小鼠KC含量下降明显，与H.F.D组相比差异显著（p<0.01）。（5）RT-PCR实验结果显示，H.F.D组小鼠主动脉组织中KC、CXCR2、TNF-α、γ-IFN、mef2a表达量增高，与control组比较差异显著。G31P处理组上述各指标表达量降低，差异有统计学意义（p<0.01）。（6）免疫组化法检测小鼠主动脉组织中MMP-2、MMP-9、PCNA的表达，发现G31P可显著抑制高脂血症诱导的上述各因子的表达，差异显著（p<0.01）。2、第二部分实验：（1）血脂：小鼠高脂饮食喂养12周后，眼球取血，收集血清检测血脂，AS组小鼠血清中CHO、TG、LDL-C均显著高于control组，而HDL-C低于control组，具有统计学意义（p<0.01），符合高脂血症诊断标准。G31P处理组，血清中CHO、LDL-C含量明显降低，同时HDL-C含量升高（p<0.01）。（2）病理学观察：光镜下AS和G31P组小鼠均可见内膜明显增厚，有斑块形成，斑块表层是一层纤维帽，部分可见破裂，下方可见大量泡沫细胞，胆固醇结晶以及大量无定形坏死物，管腔狭窄明显，说明动脉粥样硬化动物模型建立成功。主动脉根部，AS组与G31P组PA/LA比值无显著性差异。心脏冠状动脉G31P处理组斑块面积明显减少，而AS组管腔狭窄明显，两者有显著性差异（p＜0.01）。（3）ELISA法检测小鼠血清中KC的含量，发现AS组血清中KC含量显著增加，G31P组小鼠KC含量下降明显，与AS组相比差异显著（p<0.01)。（4）qRT-PCR结果显示，AS组小鼠主动脉组织中KC、CXCR2、TNF-α、γ-IFN、mef2a、PCNA表达量增高，与control组比较差异显著（p<0.01）。应用G31P处理组上述各指标表达量降低，差异有统计学意义（p<0.01)。（5）免疫组化结果显示，AS小鼠主动脉组织中CXCR2、MMP-2、MMP-9、mef2a、PCNA的表达显著增高，G31P可显著抑制上述各因子在主动脉血管组织中的表达，差异显著（p<0.01）。3、第三部分实验：（1）大鼠胸主动脉平滑肌细胞（A7r5）中存在IL-8/CXCL8受体CXCR2的表达；（2）IL-8/CXCL8可刺激A7r5细胞增殖和迁移，且具剂量依赖性，并从20ng/ml浓度开始增殖和迁移效应显著（与control相比，p<0.01）；（3）G31P可有效的抑制IL-8/CXCL8(20ng/ml)诱导的A7r5细胞的增殖和迁移（p<0.01）；（4）IL-8/CXCL8诱导A7r5细胞后，P-ERK表达量增加，且在IL-8/CXCL8作用后1小时达峰值，G31P可显著抑制IL-8/CXCL8诱导的P-ERK的表达。结论：1、G31P可通过降低血清中CHO、TG和LDL-C并升高HDL-C来改善高脂饮食引起的高脂血症，并通过降低IL-8/CXCL8、TNF-α、γ-IFN等炎性细胞因子的表达抑制小鼠主动脉血管组织的炎症反应。2、G31P可在一定程度上延缓冠状动脉粥样硬化的形成。3、G31P可抑制动脉粥样硬化形成过程中CXCR2的表达以及MMP-2、MMP-9、mef2a、PCNA的表达，从而抑制血管平滑肌细胞细胞的增殖迁移。4、G31P在体外可抑制由IL-8/CXCL8诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移。5、IL-8/CXCL8诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移与ERK信号通路相关6、G31P可以阻断ERK通路级联活化而抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移
【作者】秦元华；
【导师】高颖；
【作者基本信息】大连医科大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】IL-8/CXCL8G31P；血管平滑肌细胞；增殖；迁移；高脂血症；动脉粥样硬化；ERK；

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