香菇C_(91-3)转录组Latcirpin-3基因的原核表达、纯化及其生物学活性的研究

香菇C_(91-3)转录组Latcirpin-3基因的原核表达、纯化及其生物学活性的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-09 分类:参考文献 喜欢:2680
师大云端图书馆

【摘要】背景:恶性肿瘤严重危害人类健康,已成为重要的致死性疾病,其发病机制复杂,所以有效治疗举步维艰。尽管现代医学研究取得了巨大进步,但是大多数肿瘤仍不能被治愈。恶性肿瘤的发生受环境因素和遗传因素共同影响,在众多影响肿瘤发生的因素中,氧化应激诱导的DNA损伤及其对细胞信号转导途径的干扰在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。绝大多数复杂的生命体都依赖氧而生存,但是氧是一种高活性分子,生物体会分解氧气产生包括过氧化氢(H2O2)、自由基如羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-)以及脂质过氧化物等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),这些代谢产物可以直接或间接地对核酸、脂类和蛋白质造成暂时或永久性损伤,从而对生物体自身造成损害。活细胞中许多的氧化反应需要酶催化,氧化反应即分子间的氢质子或电子转移,这类代谢反应是生命过程所需能量的主要来源。氧化-抗氧化状态之间的不平衡造成的氧化损伤与众多疾病的发生相关,包括癌症、神经系统疾病、动脉粥样硬化、急性呼吸窘迫综合症等。基于自身保护,机体需要多种类型的抗氧化剂以维持氧化代谢的平衡。如谷胱甘肽、维生素C、维生素E以及一些酶类,包括过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)等。抗氧化酶可保护细胞免受氧化应激损伤,抗氧化酶活性和表达的失调与肿瘤发生密切相关,是肿瘤发生发展的重要影响因素。天然抗氧化剂在医药、食品等领域有着广阔的应用前景,香菇是著名的药食两用菌,开展从香菇中提取抗氧化物质的研究有一定的理论和应用价值。香菇C91-3菌株是我课题组经多年筛选得到的一株药用真菌。我们前期的实验证明,香菇C91-3菌株发酵液具有良好的抗肿瘤、抗菌作用。香菇C91-3菌株发酵液中含有多种蛋白成分。我们课题组曾对香菇C91-3菌株发酵液蛋白(LFP91-3)进行了初步分离并进行体外抗肿瘤实验研究。研究结果表明其蛋白成分具有较好的抗氧化,抗肿瘤作用,能够诱导肿瘤细胞凋亡,这些性质均有利于其成为一种良好的临床药物。近年来国内外肿瘤发病率有不断升高的趋势下,寻求新的毒副作用小、靶向作用强的肿瘤治疗药物,提高肿瘤患者的远期生存率,是当前迫切需要解决的课题。国外学者的研究结果显示,香菇菌提取物对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用,我们以前的研究中也发现从真菌中提取的混合蛋白LFP91-3可有效抑制肿瘤的生长,具有直接杀灭肿瘤细胞、提高机体免疫力等多重抗肿瘤效应,但是这些混合蛋白的成分复杂,在广泛的pH范围和分子量范围内含有大量低浓度的蛋白成分。因此,对香菇C91-3菌株蛋白成分继续进行深入研究,使之成为良好的临床抗肿瘤药物,是我们目前需要解决的问题。为此我们进行了香菇C91-3菌株转录组的研究工作,通过转录组测序、分析及生物信息学工具进行转录组的比对、筛选提示有过氧化物酶活性的抗氧化蛋白基因,获取其基因全长,用生物工程的手段得到该活性蛋白,并验证其生物学功能。目前,我们已经成功地将选定的目的蛋白在GenBank进行了序列注册GenBankAccessionNumber:KF682440),并命名为Latcripin-3。目的:本研究通构建香菇C91-3菌株pET32a-Latcripin-3表达载体,使其在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)菌株中进行重组表达,经过亲和层析得到单一目的蛋白,并对其生物学活性的进行检测来寻求香菇C91-3菌株中的活性功能蛋白;同时,通过对此蛋白的空间结构进行分析比对,阐明其诱导肿瘤细胞凋亡的途径,进而通过实验加以验证。①寻找并确定香菇C91-3菌株中抗氧化,抗肿瘤蛋白的基因序列;分析此蛋白的一级结构、二级结构,预测其空间构象及功能基团。②通过构建pET32a-Latcripin-3表达载体将香菇C91-3菌株抗氧化、抗肿瘤蛋白Latcripin-3在Rosetta-gami(DE3)菌株诱导表达,同时对表达产物进行鉴定。③纯化目标蛋白Latcripin-3,研究其对人肺癌细胞A549生物学功能影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法:①从香菇C91-3菌株菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3’-FullRACE、5’-FullRACE方法获得Latcripin-3基因,通过生物信息学软件分析Latcripin-3一级结构、二级结构、并预测其功能结构域,对其可能存在的三级结构进行同源建模。②将Latcripin-3基因克隆到表达载体pET32a(+)中,构建真核重组表达质粒pET32a(+)-Latcripin-3。用热转化的方法将此质粒转化到Rosetta-gami(DE3)中并进行诱导表达,对表达产物用Westernblot方法和质谱进行鉴定。用亲和层析的方法分离纯化目的蛋白,测定蛋白浓度。③将已鉴定的各浓度的诱导表达蛋白作用于人肺癌细胞A549,用MTT法测定目的蛋白的抑瘤率;用流式细胞术检测目的蛋白对肿瘤细胞的凋亡作用及细胞周期的影响;用电镜法检测其对A549细胞形态学影响。结果:①通过对双酶切产物核酸电泳和基因序列分析确定插入pET32a中的片段为Latcripin-3基因片段。通过对Latcripin-3进行蛋白结构域的分析发现,其蛋白三级结构极为特别,该蛋白具有多个连续α螺旋结构,最终形成一个口袋样空间结构。它的上游具有过氧化物酶超家族结构域;下游为DUF3415(Domainofunknownfunction)域,为未知生物活性的功能域。②Westernblot结果显示表达的蛋白为含有组氨酸标签的目的蛋白。诱导表达过程中,目的蛋白在加入IPTG后3小时以后完全表达,表达的总量随时间变化相对恒定。通过亲和层析,将目标蛋白纯化成功,蛋白电泳显示单一的目的条带。经过尿素梯度透析,恢复该蛋白的空间结构,并使用超滤管离心浓缩蛋白。通过LTQ质谱分析,验证该蛋白的生物学活性。采用南京凯基BCA检测蛋白浓度试剂盒测定表达蛋白浓度为0.736mg/mL。标准曲线为y=38.845x-2.5791,R2=0.9958。③抗氧化实验Latcripin-3对DPPH自由基清除呈现浓度依赖性,在低浓度(<60μg/mL)时抗与抗坏血酸的抗氧化无显著型差异(P>0.05)。④MTT法检测结果显示,不同作用时间(24小时、48小时),不同蛋白浓度A549细胞(ATCCCCL185)的生长抑制作用(OD495)与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL和60μg/mL目的蛋白的抑瘤率呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。⑤流式细胞凋亡功能结果显示,此蛋白终浓度为30μg/mL、60μg/mL具有对A549细胞早期凋亡的能力,凋亡诱导率与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),浓度为60μg/mL时诱导凋亡的作用最强。⑥流式细胞周期结果显示,随着Latcripin-3蛋白浓度的增大,G0/G1期所占的比率有降低的趋势;G2/M期所占比例明显降低的趋势,并且在Latcripin-3蛋白浓度达到60μg/mL时G2/M期所占的比率竟然为0(P<0.05)。S期所占比例明显有明显升高的趋势,当Latcripin-3蛋白浓度达到30μg/ml和60μg/mlS期比率有显著性差异(P<0.05),生长多停滞于S期。⑦电镜结果显示Latcripin-3蛋白作用后的细胞呈现凋亡状态,凋亡细胞体积变小,胞质浓缩,胞浆内空泡增多,染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状,线粒体肿胀。结论:①对获得的香菇C91-3菌株的转录组序列进行比对分析,筛选确定了很可能具有抗氧化酶活性的转录组序列Latcripin-3,根据此序列设计引物,用3’-FullRACE(RapidAmplificatioonofcDNAEnds)、5’-FullRACE方法成功获得了Latcripin-3基因全长;通过分析此蛋白的理化性质、二级结构,预测了其空间构象及功能基团。Latcripin-3蛋白具有两个功能域:一个具有过氧化物酶结构域,和一个未知的DUF3415结构域,其生物学功能可能通过这两个结构域共同发挥作用。②成功构建了重组质粒pET32a(+)-Latcripin-3;并在大肠杆菌Rosetta-gammi(DE3)宿主中成功表达;目的蛋白Latcripin-3经亲和层析被成功纯化,为进一步研究Latcripin-3的生物学功能奠定了基础。③香菇C91-3菌株转录组蛋白Latcripin-3具有清除自由基的抗氧化活性;Latcripin-3蛋白具有诱导人肺癌细胞A549早期凋亡作用,并且使肺癌细胞A549阻滞在S期,抑制该肿瘤细胞的生长。具体生物学机制有待深入研究。本实验为进一步深入揭示香菇C91-3菌株的抗肿瘤机制奠定了基础。
【作者】安晓华;
【导师】黄敏;
【作者基本信息】大连医科大学,病理学与病理生理学,2014,博士
【关键词】香菇C91-3菌株;Latcripin-3蛋白;原核表达;抗氧化;抗肿瘤;

【参考文献】
[1]黄灿.宽带多媒体卫星通信系统地面适配网关的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2010,硕士.
[2]陈诗颖.境外宗教非营利机构组织文化研究[D].吉林大学,社会工作,2013,硕士.
[3]马战宇.表面活性剂对有机污染物在多介质环境中迁移的影响[D].浙江大学,环境科学,2004,硕士.
[4]王霄.劣化混凝土性能恢复促进研究[D].中国矿业大学,结构工程,2014,硕士.
[5]张帅.私募股权基金退出机制的法律问题研究[D].北京交通大学,2014.
[6]张德林.砾岩体油藏剖面[J].石油地球物理勘探,1996,01:167.
[7]刘汉举.车载式太阳能集热器测试系统—机械系统研究设计[D].湖北工业大学,机械工程(专业学位),2013,硕士.
[8]宁秋芬.儿童对立违抗性障碍与5-HTTLPR及MAOA多态性的关联研究[D].新乡医学院,精神病与精神卫生学,2012,硕士.
[9]印鉴,陈忆群,张钢.搜索引擎技术研究与发展[J].计算机工程,2005,14:54-56+104.
[10]彭玉洁.罗伯特·勃朗宁戏剧独白诗的语用文体学试探性研究[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[11]郭延春.改革开放以来马克思主义哲学中国化及经验研究[D].延安大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[12]靳水玲.蝶骨电极在额、颞叶癫痫中的诊断价值[D].郑州大学,临床医学(专业学位),2013,硕士.
[13]赵海蕾,金德环,王淑娟.基于内部劳动力市场的民营企业激励制度研究[J].山东社会科学,2015,03:167-171.
[14]张慧.社会工作机构参与化解流动儿童教育困境研究[D].苏州大学,社会工作(专业学位),2013,硕士.
[15]王颖.论我国刑事法律援助制度的完善[D].广东财经大学,诉讼法学,2014,硕士.
[16]谭智力,朱冬姣,陈坚.三相四线UPQC直流侧电容电压波动机理及抑制方法[J].电力系统自动化,2010,07:61-65+74.
[17]王瑧瑧.PML-NBs蛋白细胞内防御机制研究和克隆一种新的Bax异构体[D].复旦大学,遗传学,2011,博士.
[18]李海芬.Pareto分布的统计分析[D].华东师范大学,概率论与数理统计,2004,硕士.
[19]白雪.评价理论视角下中国政府总理答记者问的积极话语分析[D].延安大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[20]胡凌云.基于SSH框架的销售管理系统的设计与实现[D].大连理工大学,软件工程(专业学位),2013,硕士.
[21]林海.人行天桥结构设计研究[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[22]陈楠.基于DaVinci技术的移动视频服务器的软件设计[D].哈尔滨理工大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[23]吕坤志,刘媛媛,李杰,高尚,胡来凤,蒋露露,李方实.肟菌酯关键中间体的合成[J].精细化工,2014,11:1394-1397.
[24]陈挺.真空年糕制品微生物菌群分析及贮藏过程中的品质变化[D].宁波大学,食品加工与安全(专业学位),2014,硕士.
[25]陈玉明.新型液芯光纤性能与实验研究[D].南京航空航天大学,光学工程,2004,硕士.
[26]袁彬.中国—东盟服务贸易紧急保障措施研究[D].西南政法大学,国际经济法学,2012,硕士.
[27]熊育伟.物流企业低碳发展水平评价研究[D].郑州大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[28]徐慧.论企业核心竞争力[D].安徽大学,企业管理,2004,硕士.
[29]张竟飞.面向不平衡负荷的无功功率补偿研究与设计[D].西安电子科技大学,电机与电器,2012,硕士.
[30]黄逸夫,阮文红,章明秋,容敏智.硼交联氧化石墨烯-聚乙烯醇复合材料动态力学性能的研究[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第14分会:流变学[C].中国化学会:,2014:2.
[31]韩志英,陈敏,周志坚.安钢300m~3高炉强化冶炼实践[J].炼铁.1995(S1)
[32]李中原.A公司净水设备市场开发模式研究[D].山东大学,工商管理(专业学位),2012,硕士.
[33]刘耀亮.河南三杨庄全新世以来的气候变化与洪水事件的沉积记录[D].河北师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[34]周松.半固态6063铝合金再结晶组织演变的研究[D].东北大学,材料物理与化学,2010,硕士.
[35]高洁.延安时期知识分子对马克思主义大众化的贡献[D].天津商业大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[36]龚平.T公司生产计划系统分析与优化研究[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[37]刘姗.ZnO/ZnS-Ag_2S核壳纳米棒的制备、表征及光催化性能研究[D].天津大学,工业催化,2013,硕士.
[38]郝明佳.门座起重机起升机构PLC与变频器结合控制研究[D].山东大学,机械工程(专业学位),2012,硕士.
[39]陈祥雨.CXCR1/2拮抗剂G31P对顺铂诱导荷瘤小鼠肾损伤模型保护作用的研究[D].大连医科大学,免疫学,2012,硕士.
[40]熊学军,虞浩.芜湖长江大桥的建设[J].中国铁路.2001(01)
[41]刘楠楠.克隆选择多目标优化算法及其应用研究[D].宁波大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[42]张小磊.酒精性股骨头坏死的发病特点、中医证候特点及血脂代谢相关性分析[D].北京中医药大学,中医骨伤科学,2014,硕士.
[43]王昊昊,罗建裕,徐泰山,李海峰,李碧君,朱寰,薛禹胜.中国电网自然灾害防御技术现状调查与分析[J].电力系统自动化,2010,23:5-10+118.
[44]禹亚彬.体外转染肝细胞核因子4α促进人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的研究[D].南京医科大学,外科学,2013,硕士.
[45]徐向勇.论未注册商标的法律保护[D].华南理工大学,法律(专业学位),2013,硕士.
[46]李永星.多用途智能防盗报警器的设计与实现[D].郑州大学,电子与通信工程(专业学位),2013,硕士.
[47]郭义.拟南芥富含亮氨酸重复序列类受体激酶LRRⅠ和LRR Ⅵ亚家族基因功能的研究[D].兰州大学,植物学,2012,硕士.
[48]沈虹.乐山市农村饮水安全工程项目评价研究[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[49]侯忠生,陈飞.基于元胞模型的列车运营能力研究[J].北京交通大学学报,2014,02:29-36.
[50]花晨阳.工作压力与离职倾向:心理弹性的调节作用[D].华中师范大学,应用心理,2014,硕士.

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