香菇C_(91-3)转录组Latcirpin-3基因的原核表达、纯化及其生物学活性的研究

香菇C_(91-3)转录组Latcirpin-3基因的原核表达、纯化及其生物学活性的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-09 分类:参考文献 喜欢:2715
师大云端图书馆

【摘要】背景:恶性肿瘤严重危害人类健康,已成为重要的致死性疾病,其发病机制复杂,所以有效治疗举步维艰。尽管现代医学研究取得了巨大进步,但是大多数肿瘤仍不能被治愈。恶性肿瘤的发生受环境因素和遗传因素共同影响,在众多影响肿瘤发生的因素中,氧化应激诱导的DNA损伤及其对细胞信号转导途径的干扰在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。绝大多数复杂的生命体都依赖氧而生存,但是氧是一种高活性分子,生物体会分解氧气产生包括过氧化氢(H2O2)、自由基如羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-)以及脂质过氧化物等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),这些代谢产物可以直接或间接地对核酸、脂类和蛋白质造成暂时或永久性损伤,从而对生物体自身造成损害。活细胞中许多的氧化反应需要酶催化,氧化反应即分子间的氢质子或电子转移,这类代谢反应是生命过程所需能量的主要来源。氧化-抗氧化状态之间的不平衡造成的氧化损伤与众多疾病的发生相关,包括癌症、神经系统疾病、动脉粥样硬化、急性呼吸窘迫综合症等。基于自身保护,机体需要多种类型的抗氧化剂以维持氧化代谢的平衡。如谷胱甘肽、维生素C、维生素E以及一些酶类,包括过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)等。抗氧化酶可保护细胞免受氧化应激损伤,抗氧化酶活性和表达的失调与肿瘤发生密切相关,是肿瘤发生发展的重要影响因素。天然抗氧化剂在医药、食品等领域有着广阔的应用前景,香菇是著名的药食两用菌,开展从香菇中提取抗氧化物质的研究有一定的理论和应用价值。香菇C91-3菌株是我课题组经多年筛选得到的一株药用真菌。我们前期的实验证明,香菇C91-3菌株发酵液具有良好的抗肿瘤、抗菌作用。香菇C91-3菌株发酵液中含有多种蛋白成分。我们课题组曾对香菇C91-3菌株发酵液蛋白(LFP91-3)进行了初步分离并进行体外抗肿瘤实验研究。研究结果表明其蛋白成分具有较好的抗氧化,抗肿瘤作用,能够诱导肿瘤细胞凋亡,这些性质均有利于其成为一种良好的临床药物。近年来国内外肿瘤发病率有不断升高的趋势下,寻求新的毒副作用小、靶向作用强的肿瘤治疗药物,提高肿瘤患者的远期生存率,是当前迫切需要解决的课题。国外学者的研究结果显示,香菇菌提取物对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用,我们以前的研究中也发现从真菌中提取的混合蛋白LFP91-3可有效抑制肿瘤的生长,具有直接杀灭肿瘤细胞、提高机体免疫力等多重抗肿瘤效应,但是这些混合蛋白的成分复杂,在广泛的pH范围和分子量范围内含有大量低浓度的蛋白成分。因此,对香菇C91-3菌株蛋白成分继续进行深入研究,使之成为良好的临床抗肿瘤药物,是我们目前需要解决的问题。为此我们进行了香菇C91-3菌株转录组的研究工作,通过转录组测序、分析及生物信息学工具进行转录组的比对、筛选提示有过氧化物酶活性的抗氧化蛋白基因,获取其基因全长,用生物工程的手段得到该活性蛋白,并验证其生物学功能。目前,我们已经成功地将选定的目的蛋白在GenBank进行了序列注册GenBankAccessionNumber:KF682440),并命名为Latcripin-3。目的:本研究通构建香菇C91-3菌株pET32a-Latcripin-3表达载体,使其在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)菌株中进行重组表达,经过亲和层析得到单一目的蛋白,并对其生物学活性的进行检测来寻求香菇C91-3菌株中的活性功能蛋白;同时,通过对此蛋白的空间结构进行分析比对,阐明其诱导肿瘤细胞凋亡的途径,进而通过实验加以验证。①寻找并确定香菇C91-3菌株中抗氧化,抗肿瘤蛋白的基因序列;分析此蛋白的一级结构、二级结构,预测其空间构象及功能基团。②通过构建pET32a-Latcripin-3表达载体将香菇C91-3菌株抗氧化、抗肿瘤蛋白Latcripin-3在Rosetta-gami(DE3)菌株诱导表达,同时对表达产物进行鉴定。③纯化目标蛋白Latcripin-3,研究其对人肺癌细胞A549生物学功能影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法:①从香菇C91-3菌株菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3’-FullRACE、5’-FullRACE方法获得Latcripin-3基因,通过生物信息学软件分析Latcripin-3一级结构、二级结构、并预测其功能结构域,对其可能存在的三级结构进行同源建模。②将Latcripin-3基因克隆到表达载体pET32a(+)中,构建真核重组表达质粒pET32a(+)-Latcripin-3。用热转化的方法将此质粒转化到Rosetta-gami(DE3)中并进行诱导表达,对表达产物用Westernblot方法和质谱进行鉴定。用亲和层析的方法分离纯化目的蛋白,测定蛋白浓度。③将已鉴定的各浓度的诱导表达蛋白作用于人肺癌细胞A549,用MTT法测定目的蛋白的抑瘤率;用流式细胞术检测目的蛋白对肿瘤细胞的凋亡作用及细胞周期的影响;用电镜法检测其对A549细胞形态学影响。结果:①通过对双酶切产物核酸电泳和基因序列分析确定插入pET32a中的片段为Latcripin-3基因片段。通过对Latcripin-3进行蛋白结构域的分析发现,其蛋白三级结构极为特别,该蛋白具有多个连续α螺旋结构,最终形成一个口袋样空间结构。它的上游具有过氧化物酶超家族结构域;下游为DUF3415(Domainofunknownfunction)域,为未知生物活性的功能域。②Westernblot结果显示表达的蛋白为含有组氨酸标签的目的蛋白。诱导表达过程中,目的蛋白在加入IPTG后3小时以后完全表达,表达的总量随时间变化相对恒定。通过亲和层析,将目标蛋白纯化成功,蛋白电泳显示单一的目的条带。经过尿素梯度透析,恢复该蛋白的空间结构,并使用超滤管离心浓缩蛋白。通过LTQ质谱分析,验证该蛋白的生物学活性。采用南京凯基BCA检测蛋白浓度试剂盒测定表达蛋白浓度为0.736mg/mL。标准曲线为y=38.845x-2.5791,R2=0.9958。③抗氧化实验Latcripin-3对DPPH自由基清除呈现浓度依赖性,在低浓度(<60μg/mL)时抗与抗坏血酸的抗氧化无显著型差异(P>0.05)。④MTT法检测结果显示,不同作用时间(24小时、48小时),不同蛋白浓度A549细胞(ATCCCCL185)的生长抑制作用(OD495)与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL和60μg/mL目的蛋白的抑瘤率呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。⑤流式细胞凋亡功能结果显示,此蛋白终浓度为30μg/mL、60μg/mL具有对A549细胞早期凋亡的能力,凋亡诱导率与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),浓度为60μg/mL时诱导凋亡的作用最强。⑥流式细胞周期结果显示,随着Latcripin-3蛋白浓度的增大,G0/G1期所占的比率有降低的趋势;G2/M期所占比例明显降低的趋势,并且在Latcripin-3蛋白浓度达到60μg/mL时G2/M期所占的比率竟然为0(P<0.05)。S期所占比例明显有明显升高的趋势,当Latcripin-3蛋白浓度达到30μg/ml和60μg/mlS期比率有显著性差异(P<0.05),生长多停滞于S期。⑦电镜结果显示Latcripin-3蛋白作用后的细胞呈现凋亡状态,凋亡细胞体积变小,胞质浓缩,胞浆内空泡增多,染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状,线粒体肿胀。结论:①对获得的香菇C91-3菌株的转录组序列进行比对分析,筛选确定了很可能具有抗氧化酶活性的转录组序列Latcripin-3,根据此序列设计引物,用3’-FullRACE(RapidAmplificatioonofcDNAEnds)、5’-FullRACE方法成功获得了Latcripin-3基因全长;通过分析此蛋白的理化性质、二级结构,预测了其空间构象及功能基团。Latcripin-3蛋白具有两个功能域:一个具有过氧化物酶结构域,和一个未知的DUF3415结构域,其生物学功能可能通过这两个结构域共同发挥作用。②成功构建了重组质粒pET32a(+)-Latcripin-3;并在大肠杆菌Rosetta-gammi(DE3)宿主中成功表达;目的蛋白Latcripin-3经亲和层析被成功纯化,为进一步研究Latcripin-3的生物学功能奠定了基础。③香菇C91-3菌株转录组蛋白Latcripin-3具有清除自由基的抗氧化活性;Latcripin-3蛋白具有诱导人肺癌细胞A549早期凋亡作用,并且使肺癌细胞A549阻滞在S期,抑制该肿瘤细胞的生长。具体生物学机制有待深入研究。本实验为进一步深入揭示香菇C91-3菌株的抗肿瘤机制奠定了基础。
【作者】安晓华;
【导师】黄敏;
【作者基本信息】大连医科大学,病理学与病理生理学,2014,博士
【关键词】香菇C91-3菌株;Latcripin-3蛋白;原核表达;抗氧化;抗肿瘤;

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