HIF-1α、MMP-9在重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及大黄素干预的实验研究

【摘要】目的：探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）在重症急性胰腺炎（SAP）肺损伤（severeacutepancreatitis-associatedlunginjury，SAPALI）中的表达及作用，应用中药单体大黄素干预脂多糖刺激的肺泡上皮细胞，观察HIF-1α以及肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症因子的变化。用RNA干扰的方法对肺泡上皮细胞的HIF-1α进行基因沉默，继续观察大黄素干预的sh-HIF-1α细胞中上述因子的变化。本实验旨在进一步揭示HIF-1α、MMP-9在重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用，探究其在肺泡-毛细血管屏障功能紊乱和肺水肿发病中的作用。同时探讨中药单体大黄素在脂多糖刺激的肺泡上皮细胞炎症中所发挥的作用，寻找治疗肺损伤的药物作用靶点，为临床治疗重症急性胰腺炎肺损伤提供更多的理论依据。方法：实验一:将SD大鼠随机分为假手术组（SO组，n=10）、模型组（SAP组，n=10）。假手术组仅行剖腹术,翻动胰腺。模型组采用胆胰管逆行注入5%脱氧胆酸钠（1ml/kg）建立大鼠重症急性胰腺炎肺损伤模型。各组动物在术后24h检测PaO2、PaCO2以及血淀粉酶。应用ELISA方法检测动物模型血清中HIF-1α、MMP-9以及TNF-α的活性，应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测肺组织HIF-1α、MMP-9mRNA的表达强度，采用Western-blot方法检测肺组织HIF-1α、MMP-9的表达，并观察胰腺、肺组织的病理变化。实验二：将SD大鼠随机分为假手术组（SO组，n=10）、模型组（SAP组，n=10）、二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）小剂量治疗组（2ME25mg/kg，n=10）和二甲氧基雌二醇大剂量治疗组（2ME215mg/kg，n=10）。假手术组仅行剖腹术，翻动胰腺。模型组和二甲氧基雌二醇治疗组均采用胆胰管逆行注入5%脱氧胆酸钠（1ml/kg）建立大鼠重症急性胰腺炎肺损伤模型。二甲氧基雌二醇治疗组于造模后1小时，分别向动物模型内腹腔注射HIF-1α抑制剂二甲氧基雌二醇5mg/kg，15mg/kg。各组动物在术后24h测PaO2、PaCO2、血淀粉酶、肺组织伊文思蓝含量以及肺湿干比值。应用ELISA方法检测动物模型血清中HIF-1α、MMP-9以及TNF-α的活性。应用RT-PCR检测肺组织HIF-1α、MMP-9mRNA的表达强度，采用Western-blot方法检测肺组织HIF-1α、MMP-9表达，并观察四组胰腺和肺组织病理变化。实验三：选用人肺上皮细胞系（A549）进行培养，用低（10μmol/L）、中（20μmol/L）和高（40μmol/L）三个浓度的大黄素孵育作用后，再用LPS（200ng/ml）进行刺激造模，建立模型。应用MTT实验对细胞活性进行测定。应用RT-PCR检测各组中HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA的表达强度，采用Western-blot方法检测上述因子的蛋白表达。大黄素孵育敲除HIF-1α的A549细胞系，用LPS刺激细胞，体外建立细胞损伤模型。应用ELISA检测sh-HIF-1α和sh-control两组中TNF-α、IL-6的活性，采用Western-blot方法检测HIF-1α蛋白的表达。另检测大黄素和或干扰HIF-1α条件下LPS诱导的A549细胞系培养液中TNF-α、IL-6的表达，寻找大黄素可能的作用机制。结果：SAP模型组PaCO2、肺组织湿干比、伊文思蓝含量以及血淀粉酶高于假手术组（P<0.05），而PaO2低于假手术组（P<0.05）。SAP组HIF-1α、MMP-9mRNA和蛋白表达较假手术组显著升高（P<0.05）。SAP组肺组织和胰腺组织病理评分高于假手术组病理评分（P<0.05）。应用HIF-1α抑制剂二甲氧基雌二醇干预后发现，干预治疗组PaCO2、肺组织湿干比、伊文思蓝含量以及血淀粉酶较SAP组下降，而PaO2较SAP组升高（P<0.05），同时2ME215mg/kg治疗组较2ME25mg/kg治疗组上述指标下降，PaO2升高（P<0.05）。ELISA方法检测HIF-1α、MMP-9、TNF-α，结果发现2ME2治疗组中上述因子的活性较SAP组下降（P<0.05），同时2ME215mg/kg治疗组较2ME25mg/kg治疗组上述因子的活性下降更明显（P<0.05），但是MMP-9活性在SAP和二甲氧基雌二醇小剂量治疗组中差异无统计学意义（P>0.05）。2ME2治疗组中HIF-1α、MMP-9mRNA表达较SAP组差异没有统计学意义（P>0.05），Westernblot检测发现，2ME2治疗组中HIF-1α蛋白较SAP组下调，且HIF-1α蛋白在2ME215mg/kg治疗组较2ME25mg/kg治疗组下降更明显（P<0.05）。MMP-9蛋白表达在2ME25mg/kg和SAP组中差异没有统计学意义（P>0.05），2ME215mg/kg治疗组较2ME25mg/kg治疗组MMP-9蛋白明显下降，且差异有统计学意义(P<0.05)。2ME2治疗组中的肺组织和胰腺组织的病理评分较SAP模型组明显下降，同时2ME215mg/kg治疗组较2ME25mg/kg治疗组组织的病理评分下降更明显（P<0.05）。MTT实验发现，内毒素LPS刺激肺上皮细胞损伤模型组的细胞生长活性较正常组细胞生长活性明显下降，应用大黄素治疗后发现，治疗组中细胞的生长活性较模型组有所上升，并且上升程度呈剂量依赖性（P<0.05）。LPS刺激组的HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA表达强度较正常组升高，应用大黄素治疗后，上述因子的mRNA表达情况均下调，尤以大黄素（40μmol/L）组为甚（P<0.05）。Westernblot结果发现LPS刺激组中的HIF-1α蛋白表达较正常组升高，ELISA结果发现LPS刺激组中的TNF-α、IL-6蛋白较正常组升高，应用大黄素干预治疗后，上述因子的蛋白表达明显下调，且大黄素（40μmol/L）组为甚（P<0.05）。同时，我们在大黄素处理的同时干扰HIF-1α的表达，发现IL-6、TNF-α的表达要明显低于未处理组、HIF-1α-shRNA组及单纯应用大黄素组（P<0.05），这些结果说明在抑制LPS诱导的A549炎症介质的释放的过程中大黄素可能是通过HIF-1α起作用的，同时二者在抑制炎症发生的过程中具有协同作用。结论：SAP肺损伤模型中，HIF-1α、MMP-9在肺组织中表达升高。HIF-1α抑制剂2ME2可以缓解重症急性胰腺炎肺损伤动物模型中肺泡-毛细血管屏障紊乱和肺水肿的严重程度，HIF-1α和MMP-9在重症急性胰腺炎肺损伤时肺泡-毛细血管屏障功能紊乱和肺水肿发病环节中起重要的作用。另外，大剂量应用2ME2可以明显下调MMP-9的表达，说明MMP-9与HIF-1α可能在一条炎症通路上，并且受“炎症开关”HIF-1α的调控。体外实验表明在LPS处理的人肺上皮细胞肺损伤模型中，中药单体大黄素可以下调HIF-1α以及相关炎症因子的表达，且联合应用大黄素/HIF-1α-shRNA较单用大黄或者HIF-1α-shRNA对肺泡上皮细胞起到更强的保护作用，防止肺损伤的加重和恶化。
【作者】祁冰；
【导师】陈海龙；
【作者基本信息】大连医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】重症急性胰腺炎；急性肺损伤；缺氧诱导因子-1α；基质金属蛋白酶-9；大黄素；

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